食品中蠟樣芽孢污染特點及檢測方法研究進展

伊 鋆，酈 娟，董 玲，楊 永*

（武漢食品化妝品檢驗所，湖北武漢 430014）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，B.c）自從1950年被Hauge氏首次報道其能引起食物中毒以來，就一直為學(xué)者們所廣泛關(guān)注[1]。劉秀梅等[2]的研究表明，2005年微生物造成的食源性疾病中由B.c引起的占8.9%。王洋等[3]總結(jié)了1947～2010年有文獻報道的11例B.c嘔吐型死亡案例，中國有6例，可見B.c食物中毒在我國危害性很大。

鑒于B.c污染與人們?nèi)粘ｏ嬍辰】迪⑾⑾嚓P(guān)，且在一定條件下會造成嚴重危害，本文綜述了幾類常見食品被B.c污染的特點，并總結(jié)了國內(nèi)外學(xué)者最新研究的檢測及控制蠟樣芽孢的手段，為有針對性地監(jiān)測并控制幾類食品中的污染提供參考，最大限度避免因B.c污染帶來的經(jīng)濟損失以及健康損害。

1 易污染產(chǎn)品

1.1 糧食制品

由于我國的氣候特點為南方溫暖潮濕，北方夏秋季節(jié)室溫較高，且主食為面食或米飯，又有吃隔夜米飯等生活習(xí)慣，使B.c的污染變得不容忽視。周幗萍等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，在引發(fā)嘔吐型食物中毒的食品中，糧食加工品占非常大的比例，其中米飯及其制品約占81.1%，面制品約占10.1%，而在腹瀉型B.c食物中毒中，糧食加工品占約30%的比例。近幾年國內(nèi)報道的各類糧食制品中B.c污染狀況見表1。

表1 糧食制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 1 Contamination conditions of B.cereus in cereal products

由表1可以看出，對米面制品進行統(tǒng)一抽檢分析的報告結(jié)果顯示，污染率基本在4%～15%，污染率相對較低；針對米粉、米線、米飯進行專項抽檢的結(jié)果顯示污染率相對較高，這可能與抽檢樣品量及代表性有關(guān)，但報告均未能指出具體的陽性樣品污染濃度；在針對嬰幼兒輔助食品的調(diào)查中，各份調(diào)查采樣量相對充足，但檢出率相差較大。

1.2 含乳制品

乳制品在加工、運輸、儲存等環(huán)節(jié)均易受蠟樣芽孢桿菌污染，康博燕等[16]在研究酸奶生產(chǎn)環(huán)境中芽孢桿菌污染狀況時發(fā)現(xiàn)，外包裝車間存在蠟樣芽孢污染的狀況。在奶制品中的污染情況的研究較多，據(jù)報道在我國巴氏殺菌乳春季檢出率超過70%[17]，冰淇淋中達60%[18]。近幾年我國4類含乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況見表2。

表2 含乳制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 2 Contamination conditions of B.cereus in milk products

從表2可以看出，原料乳的污染率基本為20%～35%，檢出量較高，均已超過103CFU/mL；乳粉的污染率在7.5%～35%，四份調(diào)查結(jié)果相差較大可能與抽檢產(chǎn)品品牌有關(guān)，其中兩份調(diào)查報告中未能提供具體檢出量，從已知的報告中可以看出，乳粉中總體污染量維持在較低水平；對于巴氏殺菌乳及冰淇淋近年的抽查報告報出較少，單從引用報告結(jié)果看，兩種產(chǎn)品檢出率都很高，但污染濃度相對較低。

1.3 豆類食品

豆制品制作工藝復(fù)雜，如加工環(huán)境不衛(wèi)生或在運輸和存儲過程中不注意控制溫度容易導(dǎo)致豆制品被蠟樣芽孢桿菌污染。在我國已經(jīng)有因為豆?jié){[25]，豆制品（小食品）[26]被污染引起的集體中毒事件。幾類常見豆制品的污染狀況見表3。

表3 豆制品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況Table 3 Contamination conditions of B.cereus in soybean products

由表3可以看出，發(fā)酵豆制品污染濃度相對較高。其中3份黃豆醬陽性樣本污染量達到了103CFU/g；19個腐乳樣品中有2個樣品達到106CFU/g；有16個腐乳樣品的污染量超過了103CFU/g；豆豉的調(diào)查表明雖然檢出率比較高，但陽性樣本的幾何均數(shù)檢出率均＜1 100 CFU/g。

1.4 其他類食品

除以上總結(jié)的三大類易污染產(chǎn)品外，國內(nèi)外不斷有研究報道被蠟樣芽孢桿菌污染的其他產(chǎn)品。楊紅紅等[31]通過16S rDNA序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定了B.c是導(dǎo)致桶裝番茄醬脹袋的腐敗菌之一。楊松等[32]對錦州市3個區(qū)超市和農(nóng)貿(mào)市場的新鮮海產(chǎn)品、海產(chǎn)干品、進行芽抱桿菌污染情況調(diào)查，海產(chǎn)干5份檢樣中有4份檢出，檢出量達到103～105CFU/g。黃結(jié)等[33]確認有12批保健食品被檢出B.c，其中螺旋藻片和鈣片檢出率分別為60.0%和21.1%。

2 檢測方法研究進展

2.1 常規(guī)培養(yǎng)法

常規(guī)蠟狀芽孢桿菌檢測方法主要通過特異性平板甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂選擇性分離，這種方法靈敏度高，專一性較強，但在區(qū)分蕈狀芽孢桿菌時，需要在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)數(shù)天觀察根狀生長狀況，檢驗周期較長。KIM D H等[34]研制的新型蠟樣芽孢計數(shù)培養(yǎng)基以馬血為基礎(chǔ)，加入卵黃、多粘菌素B等成分，與MYP相比，可以在樣品中背景菌較多的情況下很好地突出目標菌；盧勉飛等[35]研制的B.c顯色培養(yǎng)基HKMCB選擇的是具有高特異性的磷脂酶，與MYP相比可以直接從菌落顏色區(qū)分蕈狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。

2.2 核酸分析方法

近年來，學(xué)者們圍繞與蠟狀芽孢桿菌致病相關(guān)的4個基因hbl、nhe、cytK和ces采用PCR法實現(xiàn)了對B.c毒株的快速檢驗。PCR方法在高通量檢測及鑒定致病菌方面具有明顯的優(yōu)勢，表4列出了近幾年具有代表性的研究成果。其中，THAPA S P等[39]以cytK為靶基因，采用多重PCR方法，實現(xiàn)了同時檢測包括蠟樣芽孢桿菌在內(nèi)的5中食源性致病菌的目標。CREMONESI P等[43]采用實時定量PCR方法以ces為靶基因，更實現(xiàn)了同時檢測包括蠟樣芽孢桿菌內(nèi)的23中常見食源性致病菌。KIM J M等[37，41]則從區(qū)分致病及非致病性入手，分別采用mPCR和qPCR方法實現(xiàn)了蠟樣芽孢桿菌的快速檢測。ZHANG Z H等[38]將核酸交聯(lián)染料技術(shù)與多重PCR方法相結(jié)合，在滿足區(qū)分致病及非致病性蠟樣芽孢的前提下，消除了死菌DNA擴增信號對PCR擴增的影響，實現(xiàn)了對蠟樣芽孢活菌的檢測。MARTíNEZ-BLANCH JF等[42]利用RT-qPCR方法檢測蠟樣芽孢磷酯酰膽堿特異性磷酯酶mRNA，實現(xiàn)了對活菌的定量檢驗，在人工污染的樣品中檢出限可以達到1.1×104CFU/mL。

此外，為了縮短檢驗周期，周巍等[44]采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測方法，將酸乳經(jīng)前增菌后提取DNA進行分析，此方法特異性良好，以蘇云金芽孢桿菌DNA擴增也并無條帶出現(xiàn)，檢出限為6.4 CFU/mL，人工污染的檢出限可以達到21 CFU/mL，實現(xiàn)了縮短了檢測時間的目的。

表4 mPCR和qPCR方法檢測蠟樣芽孢桿菌常用引物Table 4 Common used primers for detection of B.cereus by mPCR and qPCR

2.3 現(xiàn)代儀器分析方法

隨著儀器制造業(yè)及信息技術(shù)的飛速發(fā)展，光譜、色譜、質(zhì)譜以及各類生物傳感器都開始在微生物鑒定方面有所應(yīng)用。萬佳蓉等[45]采用傅里葉變換紅外光譜非破壞性地分析B.c，結(jié)果表明，根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)光譜特征吸收峰可區(qū)分B.c細胞的莢膜、芽孢、貯能物質(zhì)等特殊結(jié)果物質(zhì)。鄭秋月等[46]利用變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）區(qū)分蠟樣芽孢桿菌不同長度DNA片段產(chǎn)生的特異峰形分析其gyrB基因，數(shù)百個樣本分析可以在一天完成。在FERNáNDEZ-NO I C等[47]采用微生物的鑒定領(lǐng)域今年發(fā)展起來的新型分析測試手段MALDI-TOF MS方法對收集到的57株芽孢桿菌進行分型，結(jié)果表明該方法可以有效區(qū)分芽孢桿菌，尤其可以很好地將B.c與解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌區(qū)分開。KANG X B等[48]采用殼聚糖作為交聯(lián)劑制作的雙層納米金電化學(xué)免疫傳感器檢測蠟樣芽孢的檢出限可以達到10.0 CFU/mL，靈敏度在5.0×101～5.0×104CFU/mL（R=0.996 6）范圍內(nèi)。喻勇新等[49]采用金屬氧化物氣敏傳感器檢測了TSB培養(yǎng)液中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，可以鑒別出B.c、單增李斯特菌、緩慢葡萄球菌。

3 結(jié)語

目前國際上許多國家都已經(jīng)將B.c檢測納入乳制品檢驗監(jiān)測項目，但我國還沒有把蠟樣芽孢及其毒素作為一種常規(guī)監(jiān)測項目來對待。盡管B.c腹瀉型食物中毒不會造成致死性傷害，但是嘔吐型食物中毒帶來的死亡事件不應(yīng)該被忽視。在研究食品中蠟樣芽孢桿菌污染狀況時還存在一些問題。

首先，在監(jiān)測過程中應(yīng)擴大采樣量及產(chǎn)品類別，且監(jiān)測的結(jié)果分析中應(yīng)更多關(guān)注具體污染濃度，輔助毒力基因分析結(jié)果，以全面了解蠟樣芽孢的污染狀況。在避免源頭污染的同時，尤其應(yīng)關(guān)注散裝的、保質(zhì)期時間長的、適于低溫保存的、真空包裝產(chǎn)品的污染狀況。有些調(diào)查研究在4年甚至4年后才整理出版，缺乏實效性，急需構(gòu)建全國范圍內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)平臺，及時公布調(diào)查研究結(jié)果，為以后監(jiān)測方向提供參考。其次，各類新的快速檢測技術(shù)在實際樣品檢測中還存在檢出限較高的問題，且實驗人工污染樣品主要為乳制品，種類單一很難普及應(yīng)用到所有食品檢驗中。開發(fā)快速、準確、高通量且能區(qū)分活菌的檢測方法仍然是今后的熱點研究方向。最后，今后在蠟樣芽孢桿菌污染的檢測方向方面是否需要監(jiān)測其毒素產(chǎn)生狀況及監(jiān)測毒力基因攜帶情況，或者監(jiān)測方向是否應(yīng)該監(jiān)測蠟樣芽孢桿菌族在食品中污染狀況，才能更有效地避免給商家?guī)斫?jīng)濟損失，減少給人們身體健康帶來損害，是很值得監(jiān)管部門深思的問題。

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