肉蓯蓉酶解提取工藝及抗氧化活性研究

高建德, 劉 雄*, 范凌云, 余 琰, 馬 騰

（甘肅中醫學院, 甘肅 蘭州730000）

肉蓯蓉酶解提取工藝及抗氧化活性研究

高建德1, 劉 雄1*, 范凌云2, 余 琰2, 馬 騰3

（甘肅中醫學院, 甘肅 蘭州730000）

目的 研究復合酶提取肉蓯蓉的工藝;比較傳統水提、醇提與酶解后水提、醇提，正丁醇萃取物抗氧化活性。方法 以肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作為評價指標，選擇酶用量、酶解溫度、酶解時間為主要因素，通過正交試驗確定復合酶提取肉蓯蓉的最佳工藝條件，并在此基礎上，比較不同提取方法下提取物抗氧化活性。結果 復合酶強化提取肉蓯蓉最佳工藝參數為復合酶 0.2%、 酶解溫度 60 ℃， 酶解時間 2.5 h; 等量藥材同體積肉蓯蓉提取液， 抗氧化活性依次為:酶解后醇提＞酶解后水提＞傳統醇提＞傳統水提。結論 在所得的復合酶提取肉蓯蓉工藝條件下，肉蓯蓉抗氧化活性可以顯著提高。

肉蓯蓉;復合酶;提取工藝;抗氧化活性

肉蓯蓉 Cistanche deserticola YC.Ma是我國傳統名 貴中藥材， 具有補腎陽、 益精血、 潤腸通便的功效［1］。 當前，評價肉蓯蓉質量主要是對 《中國藥典》 規定的指標成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的量進行檢定，近代藥理學研究也表明，該藥材中的松果菊苷和毛蕊花糖苷能提高機體免疫功能， 促進 DNA合成， 增強體力， 提高智能， 具有明顯的抗衰老作用［2-3］。 自由基具有高度的化學反應活性， 其過多或清除過慢， 都會加速機體衰老， 并且會誘發多種疾病［4］。鐵氰化鉀法總還原力測定、 DPPH·（二苯代苦味酰自由基）分析法被廣泛用于抗氧化活性研究，是用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏可行的方法［5］。

酶技術是近年來用于天然植物有效成分提取的一項生物工程技術。通過選用一些恰當的酶類，使細胞壁及細胞間質中的纖維素、半纖維素、果膠等物質降解，引起細胞壁及細胞間質結構產生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細胞壁、細胞間質等傳質屏障對有效成分從胞內向提取介質擴散的傳質阻力，從傳質角度促使有效成分提取率提高［6］。 為了更好地開發利用這一珍貴的資源， 本實驗在纖維素酶提取肉蓯蓉中苯乙醇苷［7］、 果膠酶酶解研究基礎上，將纖維素酶與果膠酶按一定比例混合制成復合酶，并對復合酶提取肉蓯蓉工藝進行優選，在酶解強化提取基礎上，將傳統水提、醇提及酶解強化水提、醇提進行了抗氧化活性研究，以便為肉蓯蓉科學生產合理應用提供理論依據。

1 儀器與試藥

肉蓯蓉購于甘肅省安寧醫藥公司，經甘肅中醫學院鑒定教研室楊扶德老師鑒定為列當科植物肉蓯蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質莖。 松 果菊苷對照品 （購于中國食品藥品檢定研究院， 批號 111670-200503）;毛蕊花糖苷對照品 （購于中國食品藥品檢定研究院， 批號111530-200303） ;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （ 純度 ＞96%，Sigma公司）; 正丁醇 （分析純）; 甲醇、 乙腈、 醋酸 （ 色譜純）;95%乙醇 （色譜純）; 纖維素酶、 果膠酶均購于寧夏和氏壁生物技術有限公司。

Waters高效液相色譜儀 （美國， 1525 型輸液泵， 2487型紫外檢測器， 2996 型檢測器， 717 自動進樣器， waterts Empower色 譜 軟 件）;UV1800PC 型 紫 外 分 光 光 度 計; FA1604s電子天平;DD-5M型湘液離心機;DZF-6051 型空干燥箱。

2 實驗方法

2.1 提取物測定

2.1.1 色譜條件 檢測波長為 334 nm; 流動相為乙腈-甲醇-1%醋酸 （10 ∶15 ∶75）， 體積流量 1 mL/min， 等度洗脫;Agilent HC-C18色譜柱 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） 。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取松果菊苷 10.00 mg， 毛蕊花糖苷 10.00 mg， 用流動相定容至 50 mL， 作為對照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液制備 取 20 g肉蓯蓉藥材， 精密稱定，浸泡一定時間， 加 8倍量水煎煮 2次， 每次 2 h， 合并煎液，濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉移至 50 mL量瓶中， 加流動相至刻度， 貯備待用。

2.1.4 線性關系考察 分別將松果菊苷、 毛蕊花糖苷貯備液移取2mL至10mL量瓶中， 用流動相定容， 作為對照品使用。 分別進 樣 1、 2、 4、 8、 10、 20 μL， 將 進樣量 X（μg） 和峰面積 Y做線形回歸。 結果松果菊苷標準曲線回歸方程為 Y=6.89 ×105X-6.67 ×104， r=0.999 9; 毛蕊花糖苷標準曲線回歸方程為 Y=5.74 ×105X-6.69 ×104， r= 0.999 9。 表明松果菊苷和毛蕊花糖苷均在 0.2 ～14.0 μg范圍內呈良好線性關系。

2.1.5 精密度考察 同一供試品溶液， 連續進樣 5 次， 測得松果菊苷峰面積的 RSD為 1.6%， 毛蕊花糖苷的 RSD為 1.8%。

2.1.6 重復性試驗 取同一批供試品溶液， 按 “2.1.3”項下方法制備5份溶液，以上述色譜條件測定，松果菊苷峰面 積 的 RSD 為 1.3%， 毛 蕊 花 糖 苷 峰 面 積 的 RSD為 1.9%。

2.1.7 加樣回收率試驗 取 6 個 25mL量瓶， 從用酶解強化水提的肉蓯蓉樣品液中吸取 1.00、 2.00、 3.00 mL于前3個量瓶中，后3個量瓶中加入同樣多的樣品液，然后分別精密加入相應的對照品溶液，各份均按上述測定方法進行測定，測得松果菊苷和毛蕊花糖苷的加樣回收率分別為98.9%和 97.8%， RSD分別為 1.9%和 1.8%。

2.1.8 樣品測定 分別稱取肉蓯蓉藥材粉末 20 g， 按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液， 測定對照品及供試品， 結果見圖 1、 圖 2。

圖1 混合對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 復合酶提取正交試驗方案 在單因素試驗基礎上， 發現纖維素酶用量在 0.1%， 果膠酶用量在 0.15%時對肉蓯蓉提取影響較為顯著 （另文發表）， 故為簡化實驗過程，在正交優化試驗過程中， 按照復合酶 （纖維素酶 ∶果膠酶 =2 ∶3） 配比， 并按表 1 設計選擇不同酶用量、 酶解時間、 酶解溫度進行酶解， 酶解后水提2次， 每次2 h， 提取液濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏，完全轉移至50 mL量瓶中， 加流動相至刻度， 按正交試驗要求共得到 9 份樣品液， 分別用 0.45 μm微孔濾膜濾過定容至10 mL量瓶， 標注為樣品液1 ～9 號， 測定各樣品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的量，計算其提取率。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.3 提取物的抗氧化活性測定方法

2.3.1 總還原力測定 （鐵氰化鉀法［8］） 取試樣 2mL， 加2.5mL pH 6.6 磷酸緩沖溶液、 2.5 mL 1% 鐵氰化鉀， 混合物在 50 ℃恒溫條件下， 加熱 20 min。 急速冷卻， 加 2.5 mL 10%三氯乙酸， 混勻后以 3 000 r/min 離心 10min。 取上層清液 2.5mL， 加 2.5mL蒸餾水再加 0.5mL 0.1%FeCl3， 混合均勻， 靜置 10min 后， 在 700 nm處測定吸光度。

2.3.2 提取物 DPPH·清除活性測定［5］精密稱取 DPPH 4.4mg用 95%乙醇溶解并定容至 100 mL， 得 DPPH溶液。取試樣 2 mL加 DPPH溶液 2 m L， 在室溫下反應 30 min 后于 517 nm處測定吸光度 （Ai）; 同時測定 DPPH乙醇溶液 2 mL和 95%乙醇 2 mL的吸光度 （AO） 及各樣品液 2 mL分別加 95%乙醇 2 m L的吸光度 （Aj）。 各吸光度值平行測定3 次， 取其平均值。 按下式計算 DPPH·清除率。

DPPH·清除率（%） = ［1- （ Ai-Aj） /AO］ ×100

3 不同提取方法抗氧化活性

3.1 酶解強化水提 準確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時間，按已優化復合酶酶解工藝酶解，藥渣加8倍量水煎煮2次， 每次2 h， 合并藥液， 濃縮至浸膏， 加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉移至 50 mL量瓶中， 加95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、6.00、 8.00mL置于 25 mL量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質量濃度 （換算成生藥材質量濃度分別為 0.016、0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/mL） 的溶液， 按照總還原力測定、 DPPH·方法測定。

3.2 酶解強化醇提 準確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時間，按已優選復合酶酶解工藝酶解，藥渣加8倍量75%乙醇回流提取 2 次， 每次 2 h， 合并藥液， 濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色， 正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉移至50 mL量瓶中， 加 95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于 25 mL量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質量濃度 （換算成生藥材質量濃度分別為 0.016、 0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/mL） 的溶液， 按照總還原力測定、 DPPH·方法測定。

3.3 傳統水提 準確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時間， 濾過， 藥渣加 8倍量水煎煮 2次， 每次 2 h， 合并藥液，濃縮至浸膏，加少量的熱水混懸，依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉移至 50 mL量瓶中， 加 95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于25 mL量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質量濃度 （換算成 生 藥 材 質 量 濃 度 分 別 為 0.016、 0.032、 0.064、 0.096、 0.128 g/m L） 的 溶 液， 按 照 總 還 原 力 測 定、DPPH·方法測定。

3.4 傳統醇提 準確稱取 20 g肉蓯蓉藥材， 浸泡一定時間， 濾過， 藥渣加 8 倍量 75%的乙醇回流提取 2 次， 每次2 h， 合并藥液， 濃縮至浸膏， 加少量的熱水混懸， 依次用石油醚脫脂、水飽和的正丁醇萃取至無色，正丁醇部分揮去溶劑得浸膏， 轉移至 50 mL量瓶中， 加 95%乙醇至刻度， 再分別移取上述溶液 1.00、 2.00、 4.00、 6.00、 8.00 mL置于25 m L量瓶中， 用無水乙醇定容， 配成不同質量濃度 （換 算 成 生 藥 材 濃 度 分 別 為 0.016、 0.032、 0.064、0.096、 0.128 g/mL） 的 溶 液， 按 照 總 還 原 力 測 定、DPPH·方法測定。

4 結果與分析

4.1 正交試驗結果 結果見表 2， 方差分析見表 3、 表 4。

表 2 正交試驗結果 （n=3）

表3 松果菊苷得率方差分析

表4 毛蕊花糖苷得率方差分析

從表2直觀分析可知，各因素對肉蓯蓉提取松果菊苷得率和毛蕊花糖苷的影響程度為B＞C＞A， 初步認為工藝條件最佳組合為 A3B2C3。 方差分析結果表明酶解時間（B） 具有顯著意義。 綜合分析， 確定最佳提取工藝條件是溫度 60 ℃， 酶解時間 2.5 h， 酶用量為 0.2%。

4.2 抗氧化活性結果 由圖 3、 圖 4 可知， 肉蓯蓉傳統水提、醇提物及酶解后水提、醇提物均具有一定的抗氧化活性，但在同一體積，同一批號藥材，相同生藥材質量濃度下， 4 種不同提取方法以酶解后用 75%乙醇提取鐵氰化鉀總還原力所表征的吸光度最大， （DPPH·）自由基清除率也最大。 鐵氰化鉀總還原力、 （DPPH·）自由基清除率所表現出的順序為酶解后醇提＞酶解后水提＞醇提＞水提。

5 討論

圖3 鐵氰化鉀法總還原力測定

圖4 提取物 DPPH·清除活性測定

中藥有效成分的提取和分離直接關系到其制劑的質量和療效，隨著中藥提取領域新技術的不斷應用，中藥提取技術有了極大飛躍，新技術具有效率高、耗能低等明顯優勢。 作為國家二級保護植物， 并收入 《國際野生植物保護名錄》 和瀕危動植物種國際貿易公約 （CITES） 附錄二的肉蓯蓉［9］， 提高其利用率， 節約其資源， 成為科研工作者研究的熱點。 孫萍等［10］采用微波提取技術對肉蓯蓉中總黃酮和多糖進行了提取研究，結果提取周期縮短，提取效率提高。 歐陽杰等［11］采用超聲集成技術研究了肉蓯蓉中有效成分苯乙醇糖苷類化合物、甜菜堿和肉蓯蓉多糖的提取方法。 生物酶技術自 20 世紀 90 年代用于中藥提取中以來，產生了顯著性效 益， 已 在 中藥生物堿［12］、 黃酮［13］、 香豆素［14］、 多糖［15］、 皂苷［15］提取 等方面均有 報道。 但有 關肉蓯蓉酶解技術的報道甚少，課題組以肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作為評價指標，研究了纖維素酶和果膠酶按一定比例混合提取肉蓯蓉的最佳條件，并對酶解后醇提、酶解后水提、醇提、水提抗氧化活性作了對比分析，結果表明，肉蓯蓉經復合酶輔助單元提取后，可使其中松果菊苷和毛蕊花糖苷提取率明顯提高;抗氧化方面表現出的是，酶解后肉蓯蓉采用醇提較傳統醇提抗氧化能力顯著提高，且由曲線中點的變化來看，肉蓯蓉提取物的添加量在一定實驗范圍內與其抗氧化性呈正相關。

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R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2621-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.042

2013-09-13

甘肅省 2010 年度中醫藥英才基金 （ GZK-2010-55） ;2011 年度甘肅中醫學院中青年科研基金項目 （ ZQ2011-7）

高建德 （1980—）， 男， 碩士， 副教授， 主要從事中藥制劑新技術與新劑型研究。 Tel:13919124704， E-mail:namegaojiande -2005@163.com

*通信作者: 劉 雄， 男， 教授， 碩士生導 師， 主要 從事 中藥有 效成 分與 質量標 準研 究。 Tel: （0931） 8765391， E-mail:lx@gszy. edu.cn