芫花-甘草配伍對雌性小鼠肝損傷的實驗研究

王松原, 魏玉輝, 張國強, 武新安*

（1.蘭州大學第一醫院藥劑科, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學藥學院, 甘肅 蘭州 730000）

芫花-甘草配伍對雌性小鼠肝損傷的實驗研究

王松原1,2, 魏玉輝1, 張國強1, 武新安1*

（1.蘭州大學第一醫院藥劑科, 甘肅 蘭州 730000； 2.蘭州大學藥學院, 甘肅 蘭州 730000）

目的 觀察不同比例的甘草、 芫花合用后對小鼠肝細胞膜轉運體 Na+-牛磺酸鈉共轉運體 （ Na+/taurocholate cotransporting polypeptide， Ntcp） 表達的影響， 并探討芫花-甘草配伍后所致肝損傷的可能機制。 方法 昆明種雌性小 鼠35 只， 隨機分為 5 組， 分別灌胃給予生理鹽水、 芫花水煎液、 甘草水煎液、 芫花-甘草 （1 ∶1） 混合煎煮藥液、 芫花-甘草 （1 ∶3） 混合煎煮藥液。 于給藥 7 d 后， 取小鼠肝臟組織， 用 Western bloting法考察肝細胞膜 Ntcp 的表達， 用酶循環法檢測肝細胞內總膽酸鹽的水平， 用蘇木精-伊紅染色法 （ hematoxylin-eosin staining， HE法） 研究肝臟組織病理學變化， 將所得數據通過統計軟件計算相關度。 結果 芫花-甘草配伍組肝細胞膜上 Ntcp 表達量與單位質量肝組織內膽汁酸鹽 （ Total bile acid， TBA） 顯著上升 （ P＜0.05） 并伴有肝損害;Ntcp 表達量與單位質量肝組織內 TBA的水平呈顯著正相關 （r=0.963）， 與肝臟病理損害程度正相關 （ r=0.947）。 結論 芫花-甘草配伍后可顯著升高小鼠肝細胞膜 Ntcp 表達， 引起 TBA肝內蓄積， 可能是導致雌性小鼠肝損害的原因之一。

配伍禁忌; 芫花; 甘草; 免疫印跡;Ntcp

傳統醫學將兩味中藥合用后產生毒性或使原有毒性增加的現象， 稱為 “相反” 作用［1］。 “十八反” 是中藥十八對配伍禁忌的總稱， 源自 《神農本草經》 并被歷代重要本草引用。“十八反” 常見的毒性之一是肝毒性， 而膽汁酸鹽在肝內蓄積是藥物導致肝毒性的常見形式［2］。 鈉離子 /牛磺膽酸 共 轉 運 蛋 白 （ Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide， Ntcp） 表達于肝細 胞 膜 上， 負 責 將 膽 汁 酸鹽從血液轉入細胞，其表達或功能變化均可影響膽汁酸鹽的轉運。

中藥配伍禁忌在臨床上倍受重視，但出于某些特定的治療用途，從古至今一直有將相反藥物配伍使用的方劑。芫花配伍甘草屬于十八反之一，有報道指出該配伍迄今臨床上仍短期大劑量用于墮胎等［3］。 研究證實甘草與芫花合用后對大鼠心、肝、腎臟組織有不同程度損害，以其所致的藥物性肝損傷尤為常見［4］。 為此， 本實驗擬通過研究芫花-甘草配伍給藥后對小鼠肝臟 Ntcp 表達的影響， 從轉運體角度闡明其肝損害機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 OLYMPUSAU400 全自動生化分析儀 （日本 OLYMPUS 光學株 式 會 社） ; 離 心 機 （ Allegra 64R Centrifuge BECKMAN COULTER）;DYCZ-24DN型電泳儀 （北京六一儀器廠）;DYCZ-40D轉膜儀 （ 北京六一儀器廠）; 低溫高速離心機 （ 美國 Thermo公司） ;PVDF轉移膜 （ GE Healthcare， 0.45 μm）;X線膠片 （型號:XBT-1， 日本 Kodak 公司） ; 電泳凝膠 成 像 分 析 系 統 Image Quant350 （ GE Healthcare）;LT-224S 電子天平 （ Sartorios BS400S） ; 微量進樣器（寧波市鎮海三愛儀器廠）; 水平搖床 （ 型號 WD-9405B，北京六一實驗儀器廠）。

1.2 試劑 芫花產自四川省德陽市， 甘草產自寧夏靈武市美康甘草基地，由甘肅省食品藥品監督檢驗所宋平順教授鑒定， 分別為瑞香科植物芫花 Daphne genkwa Sied.et Zucc.的干燥花蕾和豆科植物甘草 Clycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，標本收藏于蘭州大學第一醫院藥劑科實驗室樣品室。

PVDF膜 （ 美國 GE Healthcare公司， 0.45 μm） ;Rabbit polyclonal to SLC10A1 （ 美 國 Abcam 公 司， 批 號ab85611） ; β-actin 抗體 （ 武漢 博 士 的 生 物 工 程 有限 公 司，批號 BA2305）; 二抗山羊抗兔 IgG/辣根酶標記 （北京中杉金橋生物技術有限公司， 批號 98609）;PMSF（上海碧云天生物技術有限公司， 產品編號 ST506-2）;RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司， 產品編號 P0013B）; 定影液，顯影液購自天津市南開區成信醫用輔助材料廠。

2 試驗方法

2.1 供試品制備 根據陳艷琰等的研究［5］， 提取方法采用: 甘草稱定質量后加入 15 倍量的蒸餾水， 浸泡 90 min 后煎煮， 以煮沸后 60 min 作為提取時間， 煮好藥液冷卻后用布氏漏斗過濾， 再將提取液用蒸發皿濃縮至1 mL（相當于原生藥 0.375 g）， 即為甘草水煎液。 芫花水煎液制備同上，質量濃度也為 0.375 g/m L。 芫花-甘草合煎液為生藥按 1 ∶1和1∶3稱定質量后混合， 其余制備方法同上， 藥物總生藥量為 0.375 g/m L。 即為小鼠 1 ∶1 灌胃水煎液和小鼠 1 ∶3灌胃水煎液。4℃儲藏備用。

2.2 實驗動物的分組及給藥 雌性昆明種小鼠 35 只， 體質量 20 ～22 g， 購于蘭州大學動物實驗中心， 合格證號SCXK （甘） 2004-0006。 根據于大猛等的研究芫花-甘草臨床常用劑量為 1 ∶1， 另根據陳艷琰等的研究芫花-甘草 1 ∶3時合煎液毒 性 成分總溶 出 率 最高［3，5］。 同時根 據 生 藥總量不變原則。小鼠隨機分成5組:對照組、芫花組、甘草組、芫花-甘草 1 ∶1 合用組和芫花-甘草 1 ∶3 合用組， 每組 7只。各組分別灌胃給予生理鹽水、芫花水煎液、甘草水煎液、 小鼠 1 ∶1 灌胃水煎液和小鼠 1 ∶3 灌胃水煎液 15 g/（kg·d）。 于灌胃 7 d 后處死， 取其肝臟組織。

2.3 病理檢查 小鼠肝臟置于 10%甲醛溶液固定 24 h 后，經乙醇脫水、二甲苯透明、 石蠟包埋、 切片、 HE染色、 光學樹脂封片，于光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理形態學變化。

2.4 蛋白免疫印跡 取小鼠肝臟 0.04 g， 液氮研磨后加入RIPA裂解液提取蛋白。 將處理好樣品用 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離， 電轉移至 PVDF膜上。 含 5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉 1 h， 分別加入 Ntcp （1 ∶3 000） ， β-actin（1 ∶3 000） 一抗， 4℃孵育過夜， 分別加入二抗山羊抗兔IgG （1 ∶3 000）， 室溫搖床上孵育 90 min， ECL化學發光法發光顯跡，經化學方法顯影定影。

化 學 發 光 顯 色 的 western blotting結 果 經 GE Image Quant350 電泳凝膠成像分析系統掃描后， 用 ImageJ 1.34 版本進行光密度分析，密度分析結果經內參蛋白校正，考察目標蛋白相對含有量的變化。

2.5 肝組織膽汁酸鹽 （TBA） 檢測 取肝組織 100mg， 剪碎， 加入 1 mL 75%乙醇溶液， 用組織勻漿器勻漿， 肝勻漿液 50 ℃孵育 2 h 后， 6 000 ×g 離心 10 min， 取上清 0.05 mL， 備用。 按照膽汁酸酶循環法檢測試劑盒操作標準測定樣品 TBA水平。

2.6 統 計 學 處 理 利 用 SPSS 19.0 for Windows XP統 計 軟件， 計量資料采用表示。 對小鼠肝臟病理分級組間比較采用 Ridit分析， 其余同一指標組間比較采用 t檢驗; 兩指標間關系采用 Spearrman 秩相關分析， 檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 肝臟轉運體 Ntcp 的表達 肝細胞膜轉運體 Ntcp 的表達見圖 1。 與對照組相比， 芫花和甘草合用組 Ntcp 的 表達均有明顯升高 （P＜0.05）， 其中芫花-甘草 （1 ∶1） 合用組顯著上升 （P＜0.01） 。 單給芫花和甘草對 Ntcp 的表達無顯著影響 （P＞0.1）。

3.2 肝組織病理檢查 各組小鼠灌胃給藥后肝組織病理變化見圖 2。 對照組 （ 圖 2A） 肝組織結構清晰， 肝細胞形態正常; 芫花組 （圖2B） 部分肝細胞羽毛狀變性， 壞死及肝竇擴張; 甘草組 （ 圖 2C） 少量肝細胞水腫; 芫 花-甘草（1 ∶1） 合用組 （ 圖 2D） 肝細胞彌漫水腫， 氣 球樣變 及顆粒樣變，散在點灶狀肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤，散在肝細胞嗜酸變。 芫花-甘草 1 ∶3 合用組 （圖 2E） 肝細胞彌漫水腫，氣球樣變，被膜下肝細胞彌漫羽毛狀變性，散在肝細胞嗜酸變，散在肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤。

圖 1 肝細胞膜轉運體 Ntcp的表達 （n=7）

參考王明宇的方法［6］， 根據實驗各組肝組織變性情況的不同， 分為4級， “-” 肝細胞形態和組織正常， “+”肝細胞水腫，未見肝細胞壞死，“++”少許肝細胞壞死，炎細胞浸潤。 “+++” 為點灶狀肝細胞壞死，炎細胞浸潤，細胞嗜酸變。

根據各組小鼠肝組織變性情況進行半定量分析，結果表明，對照組肝臟結構基本正常;單用甘草組對肝細胞無明顯影響; 單用芫花組對肝細胞有損傷; 芫花-甘草 （1 ∶1） 合用后對細胞損傷明顯增加; 芫花-甘草 （1 ∶3） 合用后比（1 ∶1） 合用對細胞危害相對減輕。 經 Ridit分析， 各組間病理損害程度有顯著的差異 （P＜0.05）， 見表 1。

圖 2 各組小鼠灌胃給藥 7 d后肝組織病理變化圖 （ ×400 HE）

表1 小鼠肝臟組織變性半定量分析結果

3.3 肝組織 TBA水平檢測 各組肝細胞 TBA積累量見圖3。 與對照組相比， 除甘草組輕微下降外 （P＞0.1）， 各組均有上升。 其中芫花組與芫花-甘草 （1 ∶1） 合用組有顯著上升 （P＜0.05）。 芫花-甘草 （1 ∶3） 合用組也有輕微上升，但因為個體差異過大，而與對照組沒有顯著性差異。結果表明甘草能夠輕度降低 TBA在肝細胞內的蓄積， 而芫花則相反， 可以增加肝細胞內 TBA的水平。 甘草和芫花合用后， 肝細胞內膽汁酸水平大幅上升， 造成嚴重的 TBA蓄積。 初步分析認為: 芫花-甘草 （1 ∶1） 合用后， 與其他各組相比， Ntcp 上升與 TBA蓄積現象明顯加重。 病理檢查結果也證明， TBA蓄積嚴重的小鼠其肝損害也較重 （見表2）。 由于甘草降低 Ntcp 和 TBA的肝保護作用， 芫花-甘草（1 ∶3） 合用時， 肝損害較 （1 ∶1） 組輕。 如芫花-甘草（1 ∶1） 合用組肝細胞水腫及細胞壞死遍布全肝， 芫花-甘草 （1 ∶3） 組僅限于血管周圍; 芫花-甘草 （1 ∶1） 組膽小管增生較芫花-甘草 1 ∶3 組明顯加重。

3.4 相關分析 Ntcp 值 為 曝光所得 Ntcp 蛋白 光 密 度值經內參蛋白矯正后的樣品平均值 （見表 2）。 TBA值為單位質量肝臟組織內 TBA水平。 經相關分析結果顯示， 在雙側置信度為 0.05 時， Ntcp 與 TBA為顯著正相關 （ r=0.963，P=0.037）， 與 病 理 損 害 程度正 相 關 （ r=0.947， P= 0.053）， 病理分級與 TBA無顯著相關性 （r=0.827， P=0.173）。 這說明小鼠肝臟內 Ntcp 的上升與 TBA的蓄積以及肝臟的病理損害存在直接聯系。

圖3 肝細胞 TBA積累量

表 2 不同病理 分 級下小鼠 N tcp值 與 TBA （， n=7）

表 2 不同病理 分 級下小鼠 N tcp值 與 TBA （， n=7）

病 理分級 動 物數 Ntcp 表 達 TBA/（ μmol·L-1）-8 0.56 ±0.17 30.05 ±4.92 + 10 0.64 ±0.17 32.15 ±4.61 ++ 8 0.72 ±0.22 32.21 ±10.51 +++ 9 0.99 ±0.31 51.02 ±10.43

4 討論

研究結果表明，單獨給予小鼠芫花或甘草水煎劑后，與對照組相比， 芫花對小鼠肝臟 Ntcp 表達有誘導作用， 甘草則為抑制作用， 但均未見明顯的肝損傷。 給予芫花-甘草不同比例 （1 ∶1、 1 ∶3） 合煎劑后均可造成明顯的肝損傷，其中以芫花甘草1∶1組最為嚴重。

Ntcp 轉運體表達于肝細胞膜上， 負責將 TBA從血液攝入肝細胞。 TBA是膽汁的主要成分之一， 在肝臟中大部分以有機陰 離子形式 存 在， 對 肝細胞具 有 一定毒性［7-10］。 隨著肝細胞內 TBA水平的增加， 肝細胞會逐漸發生病理變化直至凋亡［11-13］。 本實驗中， 甘草-芫花配伍用藥后， 隨芫花比例升高， Ntcp 值與 TBA值同步升高， 致使肝損害程度增加。 當芫花甘草比例為 1 ∶1 時， 肝臟 Ntcp 表達升高最為顯著 （0.99 ±0.31）， 肝 細 胞 內 TBA的 蓄 積 也最 為 嚴 重（51.02 ±10.43 ） μmol/L。 由此可見， 芫 花-甘草配伍 后，隨芫花比例的升高， 肝臟 Ntcp 的表達隨之升高， 從而導致肝細胞內 TBA的過量蓄積， 可能是造成小鼠肝損傷的主要原因之一。

芫花-甘草配伍影響小鼠肝細胞 Ntcp 表達的具體機制尚不清楚。 有報道指出， 當肝細胞內 TBA升高或肝臟出現病理損害時，肝細胞核內的法尼酯衍生物 x受體將被激活，通過其信號通路影響下游基因轉錄與翻譯， 抑制 Ntcp 表達以促進 TBA轉運［14］。 但是， 這一現象在本實驗中并不明顯。 芫花-甘草配伍是否通過干擾該信號通路來影響 Ntcp 表達，有必要對其調控機制進行更深入的研究。此外，肝細胞中負責膽酸鹽外排的 BSEP轉運體的變化尚待進一步研究。

［1］ 曹永生， 劉向紅，陳愛萍， 等.相反中藥的臨床應用及研究概況［J］.中成藥， 2001， 23（11）:847-849.

［2］ 任 可， 徐 燦，金震東， 等.熊去氧膽酸治療膽汁淤積性肝病研究進展 ［ J］.臨床肝膽 病雜志， 2002， 18 （4 ）: 199-201.

［3］ 于大猛， 瞿 融.芫花甘草同方配伍研究概述與基層醫院應用現狀［J］.中國實驗方劑學雜志， 2011， 17 （21）: 296-298.

［4］ 衡晴晴， 徐 立.中藥十八反 “藻戟遂芫俱戰草” 的毒理學研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志， 2013， 19（11）: 348-352.

［5］ 陳艷琰， 錢大瑋，尚爾鑫， 等.基于化學成分相互作用探討芫花與甘草配伍禁忌的機制［ J］.藥學學報， 2012， 47（8）:1043-1048.

［6］ 王明宇， 劉 強，車慶明， 等.靈芝三萜類化合物對3種小鼠肝損傷模型的影響［J］.藥學學報， 2000， 35（5）: 326-329.

［7］ 張國強， 周 燕，魏玉輝， 等.茵梔黃顆粒對膽管結扎大鼠肝細胞膜轉運體 Mrp2， Ntcp 及 Bsep 表達的影響［ J］.中成藥， 2012， 34（9）:1644-1648.

［ 8 ］ Trauner M， Boyer JL.Bile salt transporters:molecular characterization， function， and regulation［ J］ .Physiol Rev， 2003， 83（2）:633-671.

［ 9 ］ Wei Y， Zhao L.Passive lung-targeted drug delivery systems via intravenous administration［ J］ .Pharm Dev Technol， 2013（10） : 1-8.

［10］ 熊筱娟， 肖小華， 徐麗英.烏索酸對小鼠急性免疫性肝損傷的影響［J］.中成藥， 2005， 27（11）:1352-1354.

［11］ 陳夏娟， 徐 立， 余 果， 等.海藻， 芫花反甘草的研究進展［J］.中草藥， 2012， 43（5）:1024-1027.

［12］ 胡瑞德.病理學［ M］.北京: 人民衛生出版社， 2000: 285-370.

［13］ Li D， Sun J， Sun H， et al.Bile salt induces apoptosis of hepatocytes:themechanism of hepatic function injury during obstructive jaun dice［ J］ .Chin JSurg， 1998， 36（10） :62.

［14］ Landrier JF， Eloranta JJ， Vavricka SR， etal.The nuclear receptor for bile acids， FXR， transactivates human organic solute transporter-αand-βgenes［ J］ .Am J Physiol Castrointest Liver Physiol， 2006， 290（3） :G476-G485.

R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2605-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.037

2013-09-16

王松原 （1987—）， 女， 碩士研究生， 研究方向: 臨床藥學。 Tel:18293154230， E-mail:w.songyuan@gmail.com

*通信作者: 武新安 （1962—）， 男， 教授， 博士生導師， 研究方向: 藥物間的相互作用與轉運體的關系。 Tel: （0931） 8616392， E-mail:xinanwu6511@163.com