精子發生的內分泌激素調節

李江源

（解放軍總醫院內分泌科，北京 100853）

精子發生是一個復雜的生物學過程，精原干細胞（As）具有自我復制能力，As細胞分化產生Apr和Aal精原細胞，Aal細胞進一步分化為A1-4和B型精原細胞，后者減數分裂形成精母細胞，精母細胞經過細線期、偶線期和粗線期形成單倍體精子細胞，再經過變態形成精子。精子從生精小管上皮釋放入管腔，進入附睪繼續發育，成為可以使卵子受精的成熟精子［1］。正常的精子發生有賴于下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸系功能的完整，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素抑制激素（GnIH）；垂體分泌的卵泡刺激素（FSH）和黃體生成激素（LH）以及睪丸分泌的睪酮（T）和雌二醇（E2）相輔相成，構成負反饋調節軸系，維持著精密的生理平衡，是精子發生的必備條件。此外，激素受體和受體后信號轉導，局部的旁分泌和自分泌激素以及細胞因子、生長因子和化學刺激因子等也是不可或缺的［2］。近年來利用轉基因動物模型對上述內分泌激素調節精子發生進行了大量的研究，使我們對精子發生過程內分泌激素的調節有了更加深入的認識。本文簡要回顧這方面的進展。

一、促性腺激素釋放激素（GnRH）

人類的GnRH 神經元約有1 000個，細胞呈圓形、卵圓形或梭形，定位于下丘腦前區和視前區，沿嗅球后部到弓狀核散在分布，其軸突經過下丘腦-漏斗束到達正中隆突。GnRH 神經元合成和分泌GnRH（也稱GnRH1）10肽，通過正中隆突-垂體門脈系統進入垂體前葉，作用于促性腺細胞。另一組GnRH 神經元的軸突經終板血管器止于血腦屏障［3］。人類的GnRH 受體為1型受體（GnRHR1），是視紫質樣G-蛋白受體超家族成員，分布于垂體、胎盤、性腺、乳腺、前列腺和免疫細胞。GnRHR1有7個穿膜環，第7個穿膜環的細胞內部分C-端缺失，C-端與受體內在化和失敏感性有關，C-端缺失有助于防止受體迅速內在化［4］。

在調節生殖的內分泌激素系統中，GnRH 神經元處于最頂端，GnRH 神經元脈沖式分泌GnRH 是青春期發育啟動的標志，而精子發生則是青春期發育三個重大事件（第二性征發育、精子發生和迅速長高）之一。脈沖分泌方式是GnRH 神經元的固有特性，與細胞間的信號交流無關。GnRH 神經元之間形成神經網絡，在功能上協調一致，稱為“脈沖發生器”。GnRH 脈沖在男性相對固定，90～120min一個脈沖，胚胎期因為GnRH 神經元遷徙、發育或功能異常，可引起無青春期發育和不育，臨床上稱為特發性低促性腺激素性性腺功能減退（IHH）或Kallmann綜合征；女性的GnRH 脈沖頻率有周期性變化，30～120min一個脈沖，頻率變化是月經周期的基礎，其機制未明；頻率過低可引起下丘腦性閉經和不育；而長期高頻率可導致不育和多囊卵巢綜合征（PCOS）。通過外周血管5～10min頻繁采血，進行LH 脈沖分析，是研究人類下丘腦GnRH 脈沖分泌的重要方法［5］。LH 的脈沖頻率與GnRH 脈沖頻率的同步率大于90%，FSH 脈沖的同步率較低，原因可能是目前FSH 的測定方法靈敏度不高［6］。

GnRH 調節垂體前葉促性腺細胞的分泌功能，脈沖式間斷刺激起興奮作用，連續刺激起抑制作用；較快的頻率有助于糖蛋白α-亞單位（GαSU）和黃體生成素β亞單位（LHβ）的合成，而較慢的頻率促進卵泡刺激素β亞單位（FSHβ）的合成。其機制仍未完全闡明，目前認為，受體后信號轉導的途徑不同是重要的原因之一。GnRH 與GnRHR1結合后的信號轉導涉及絲裂原激活蛋白激酶（MAPK），細胞外信號調節激酶（ERK），jun-N-端激酶（JNK）和P38。在體外培養條件下，以不同頻率的GnRH 刺激純化垂體促性腺細胞，發現低頻率激活MAPK-ERK 途徑更快和更持久，促進了FSHβ的轉錄；而高頻率則MAPK 磷酸酶途徑的反應更強，有利于LHβ的合成［7］。

體外培養的大鼠Leydig細胞經GnRH 激動劑阿拉瑞林（alarelin）處理后，3β-類固醇脫氫酶的表達增強，T 的合成和分泌增加。早期研究已證明Sertoli細胞能分泌GnRH，GnRH 在睪丸內可能是以旁分泌方式調節Leydig細胞分泌T 的功能［8］。

二、促性腺激素抑制激素（GnIH）

每一種細胞功能的調節都是既有促進因子，也有抑制因子，以維持平衡。自1971年在豬的下丘腦發現GnRH 以來，許多科學家一直在尋找與GnRH對應的抑制激素而沒有結果，直至2000年Tsuksui等［9］在鵪鶉垂體培養的研究中發現了GnIH。后來在脊柱動物和哺乳動物得到了證實。人類的GnIH有兩種分子，分別稱為RF 相關肽-1（RFRP-1）和-3（RFRP-3），它們的受體分別稱為NPFF1（GPR 147）和NPFF2（GPR 74）。GnIH 定位于下丘腦背內側核和室周核。功能研究提示，GPR 147的親和力高，是GnIH 的主導受體。GnIH 的生理作用一是抑制GnRH神經元合成和釋放GnRH，二是直接抑制垂體促性腺細胞合成和分泌LH 和FSH，人類垂體存在GPR 147受體［10］。

Smith等［11］通過對動情期和動情間期母羊垂體門脈采血測定GnIH，發現GnIH 呈脈沖式分泌，動情間期的脈沖頻率和幅度比動情期高。下丘腦-垂體離斷母羊，LH 對GnRH 的反應程度在加入GnIH 后減低，表明GnIH 是通過垂體門脈系統進入垂體前葉，并調節其功能的。Zhou等［12］研究GnIH 和GPR 147在地鼠睪丸的表達，發現GnIH 在精母細胞、圓形精子細胞和早期長形精子細胞表達；GPR 147在精子發生的各期生精細胞、管周肌樣細胞、粗線期和成熟分裂精母細胞以及圓形和后期長形精子細胞表達。提示GnIH 在地鼠睪丸有旁分泌和自分泌作用，調節生精細胞的分化。

三、黃體生成激素（LH）

LH 和FSH 屬于糖蛋白激素，分子結構為二聚體（α-和β-亞單位）。它們有相同的GαSU，LHβ和FSHβ表達各自的生物學特性，β-亞單位也是各自合成LH 和FSH 的限速步驟。LH 和FSH 是直接調節睪丸精子發生的激素，可以說是精子發生啟動的開關，其作用十分重要。

LH 的主要作用是促進Leydig細胞合成和分泌T，一方面維持正常的血漿T 水平，另一方面維持比外周循環約高100倍的睪丸內T 濃度，睪丸內T 以旁分泌方式作用于Sertoli細胞和管周肌樣細胞，是正常精子發生所必需的；以自分泌方式作用于Leydig細胞本身，維持細胞的數量和功能。LHβ基因失活性突變的男性胎兒宮內發育正常，因為胎盤分泌的絨促性素補償了缺失的LH，但是，無青春期發育和精子發生［13］。敲除LHβ基因的雄性小鼠隱睪，T 水平低，無精子發生。LH 受體基因敲除（LuRKO）小鼠睪丸小，T水平降低、LH 水平升高，生精細胞分化停滯于圓形精子細胞早期階段。與正常小鼠比較，LuRKO小鼠睪丸全基因組轉錄，存在青春期前T 不敏感期和青春期后的T 敏感期，在T 敏感期補充T 治療可以糾正LuRKO 的生理缺陷［14］。在女性，LH 刺激卵泡膜細胞合成雄激素，刺激顆粒細胞合成孕酮，FSH 則刺激顆粒細胞芳香化酶表達，將雄激素轉化為雌激素。敲除LHβ或LHR 基因的雌性小鼠，性激素水平降低，卵泡發育停滯［15］。

四、卵泡刺激素（FSH）

FSH 主要作用于Sertoli細胞，刺激其增殖（決定數量）和分化（功能成熟）。成年恒河猴切除一側睪丸后，對側睪丸體積增大，4代分化精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞數量增加，血漿FSH 水平和睪丸內T 水平增高。切除垂體或注射GnRH拮抗劑的恒河猴，單獨補充FSH 或T 都可以刺激精原細胞的分化。恒河猴的內源性FSH 和LH 被GnRH 拮抗劑阻斷后，立即分別以脈沖方式輸入重組人FSH（rhFSH）或重組人LH（rhLH），以血漿FSH 和LH 達到拮抗劑阻斷前水平為正常化終點。與對照組比較，輸入rhFSH 組睪丸容積、生精小管容積和每個Sertoli細胞內的生精細胞數量顯著增加，增加的生精細胞主要是4代B型精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞，而Aps和Apl無明顯變化；輸入rhLH 組沒有這種變化［16］。

GnRH 基因修飾導致不能產生正常GnRH 10肽分子的促性腺激素缺乏小鼠（hpg）和敲除Sertoli細胞雄激素受體（AR）的hpg小鼠（hpg.SCARKO）的生精細胞仍有部分發育；而全部AR 敲除hpg 小鼠（hpg.ARKO）與hpg小鼠比較，睪丸縮小、Sertoli細胞和生精細胞數量減少。注射hrFSH 7d后，hpg小鼠精原細胞和精母細胞數量增加，有圓形精子細胞形成；hpg.SCARKO和hpg.ARKO 小鼠只有精原細胞和精母細胞數量增加，沒有圓形精子細胞出現。hpg和hpg.SCARKO 小鼠的Leydig 細胞數量增加，而hpg.ARKO小鼠則否。說明FSH 可以誘導精子發生，但不能完成減數分裂；FSH 通過AR 對維持Leydig細胞數量起重要作用［17］。與正常小鼠比較，FSH 受 體 敲 除（FSHRKO）、SCARKO、FSHRKOSCARKO、ARKO 和FSHRKO-ARKO 各型轉基因小鼠在出生后，睪丸容積逐漸縮小，萎縮的嚴重程度依 次 為FSHRKO-ARKO ＞ARKO ＞FSHRKOSCARKO＞SCARKO＞FSHRKO，到了成年期，情況最好的FSHRKO 小鼠，睪丸容積比正常小鼠縮小了約40%；Leydig 細胞數量減少以FSHRKOARKO 和ARKO 小 鼠 最 嚴 重，FSHRKO 和FSHRKO-SCARKO 小鼠輕度減少，SCARKO 小鼠無明顯變化。生精細胞在FSHRKO-ARKO 小鼠幾乎完全 消 失，FSHRKO-SCARKO 和ARKO 小 鼠 嚴 重 減少，FSHRKO 和SCARKO 小鼠輕度至中度減少。上述結果表明，正常精子發生需要FSH 和T 的協同作用，缺乏任何一方，都會使睪丸的各型細胞受損，如果兩者都缺乏，則不能啟動精子發生［18］。

FSH 對女性生殖是不可或缺的，對男性亦起重要作用，但并非必須。FSHβ基因突變的男性患者仍有青春期發育，只是無精子發生［19］。FSHβ 或FSHR 基因敲除雄性小鼠睪丸小、血清T 水平顯著降低、Leydig細胞數量減少、少精子；而雌性小鼠無卵泡發育、不育［20］。

五、睪酮（T）

T 對于精子發生具有非常重要的作用，T 反饋抑制LH 的釋放，卻能刺激FSH 的分泌，這是促性腺激素缺乏患者補充T 可以誘導精子發生的原因。Leydig細胞在睪丸內創造了一個非常高濃度的T環境（340～2 000nmol／L），而血清水平只有8.7～35nmol／L，前者是后者的25～125倍，如果睪丸內的T 濃度＜70nmol／L，精子發生過程不會啟動。AR 存在于Sertoli細胞、Leydig細胞和管周肌樣細胞，生精細胞是否存在AR 尚無定論，從功能上看，生精細胞并不需要AR。T 對精子發生所起的作用體現在：（1）促進血睪屏障緊密連接（tight junction，TJ）的構成和功能；（2）促進附睪的發育和功能；（3）促進生精細胞在Sertoli細胞的附著和分化；（4）促進精子釋放［21］。

1.緊密連接（TJ）的構成：TJ從青春期精子發生開始，兩個Sertoli基底部之間形成TJ，將生精小管分隔為基底室和近腔室，前者只有精原細胞，后者含有精母細胞和各期精細胞。TJ不僅保護生精細胞免受免疫系統的攻擊，亦為生精細胞構建了一個特異性激素、細胞因子和營養環境。睪丸灌注高滲液體是評價血睪屏障的一種方法，10d齡正常小鼠和SCARKO 小鼠灌注后生精小管所有細胞皺縮，提示尚無有效血睪屏障形成；15d齡正常小鼠灌注后皺縮的細胞顯著減少，提示血睪屏障已開始構建，而SCARKO 鼠尚無這種變化。定量分析顯示，50d齡成年期正常小鼠99.7%已建立了完整的血睪屏障，而SCARKO 小鼠只有84.7%。電鏡觀察，正常小鼠10d齡時，生精細胞與Sertoli細胞之間以及Sertoli細胞與Sertoli細胞之間放射性鑭可以自由通過，15d齡時，大多數生精小管已形成TJ結構，放射性鑭被擋在管腔側；而SCARKO 小鼠出現這種情況少見；電鏡觀察證明了高滲液體灌注實驗的結果。說明當缺乏T 的作用時，Sertoli細胞不能有效地構建起血睪屏障［22］。

2.附睪：70年代的研究已經證明，附睪的發育和功能完整有賴于T 的作用。胚胎期缺乏T，附睪不能發育；成年期去勢，附睪重量下降、萎縮凋亡，管腔內精子消失。附睪AR 基因敲除小鼠（Prox-EARKO鼠），青春期后出現附睪頭梗塞、無精子。顯微鏡下，附睪上皮高度縮短、主細胞胞漿減少、管腔內徑增大、管間間隙擴大、睪丸液斷流。一些標本可見精子壅塞。多數生精小管生精細胞消失，梗塞部位遠端出現上皮內囊腫，管腔蓄積透明樣物質。輸出管、睪丸網和生精小管擴張，睪丸受壓萎縮［23］。

3.生精細胞分化：異體移植研究發現，生精細胞具有種族特異性的內在程序，規范生精細胞增值和分化的時間和步驟。要成功地完成整個分化程序，即從精原細胞到精子，從Sertoli細胞基底部到管腔，最后釋放精子，有賴于局部環境提供的信號和營養。Sertoli細胞與生精細胞之間的交流通過間隙連接（gap junction）、外胞漿特異化（ectoplasmic specialization）和管球復合體（tubulobulbar complexes）進行；Leydig細胞分泌T，以旁分泌方式影響Sertoli細胞的分化和功能。生精小管管周肌樣細胞構建了生精小管的基板，維持睪丸內各種細胞之間的交流，調節生精小管的收縮運動和精子釋放，管周肌樣細胞AR 基因敲除（PTM-ARKO）小鼠的生精細胞全部消失，比SCARKO 小鼠的情況還要嚴重［24］。T 至少控制著生精細胞分化的四個階段：精原細胞分化、減數分裂、精子細胞的分化和精子釋放。用T 處理hpg.SCARKO 小鼠，可見睪丸容積增大、精囊重量增加、生精小管直徑增大、出現管腔、部分生精小管出現精子發生、發育階段可達圓形精子細胞。hpg.SCARKO 小鼠的血清FSH 水平顯著低于正常，補充T 可使血清FSH 水平升高，許多情況下，T 可以獨立啟動精子發生，原因即在于T 在一定程度上可以誘導垂體分泌FSH［25］。

臨床上，無論是睪丸原發性疾病（如Klinefelter綜合征），下丘腦-垂體疾病（如Kallmann綜合征，垂體前葉功能減退）或T 作用阻礙（雄激素不敏感綜合征）的患者都沒有生育能力。一部分少精子癥或無精子癥患者存在AR 基因突變，LH 和T 水平相對升高，而第二性征發育正常。AR 基因第一外顯子CAG 重復序列的正常長度為9～36，超過正常范圍可引起Kennedy綜合征、X-連鎖遺傳、四肢近端肌肉進行性麻痹和萎縮、男子乳房發育和漸進性不育。即使CAG 重復序列長度在正常范圍內，長度相對較短者雄激素效應強，相對較長者雄激素效應弱，并可出現精子發生障礙［26］。

4.精子釋放：成熟的精子細胞與Sertoli細胞本體分離，釋放進入生精小管管腔的過程稱為精子釋放。大鼠的精子釋放始于精子發生的Ⅶ期，結束于Ⅷ期。釋放進入管腔的精子很快到達附睪，其殘余胞漿通過胞飲作用重新被Sertoli細胞吸收。這一過程在形態和結構上發生的關鍵變化是精子細胞胞漿和胞核的重塑，形成前精子細胞（spermatozoan），為脫離Sertoli細胞作好準備。同時，Sertoli細胞形成與前精子細胞聯結的特異性外胞漿，它的向外延伸將前精子細胞逐步推向管腔［27］。外源性T注射通過抑制LH 的分泌而使睪丸內T 水平下降，從而抑制精子發生，這是T 作為男子避孕藥的理論依據。男子接受T 避孕方案時，精子釋放失敗，精子細胞滯留并被Sertoli細胞吞噬［28］。

精子釋放是一個復雜的過程，參與調節的激素有FSH、T、E2和催產素。成年大鼠阻斷內源性FSH 和LH 后，約有50%的精子釋放失敗；用氟他胺阻斷AR，約90%的精子不能釋放［29］。外源性雌激素（100μg·kg-1·d-1，共10d）抑制了FSH 和睪丸內的T 水平，使睪丸內的雌激素水平升高5 倍，大鼠生精小管中Ⅶ期和Ⅷ期生精細胞的調亡增加，精子釋放失敗［30］。在精子釋放過程的起始階段，Leydig細胞合成和分泌催產素，刺激生精小管收縮，其作用在精子釋放期達到高峰。轉基因小鼠過度表達催產素可使精子釋放提前；而缺乏催產素的小鼠精子釋放延遲［31］。

六、雌二醇（E2）

人體內的雌激素包括E2、雌酮和雌三醇，以E2的作用最強，是體內的主導雌激素。男性血液中的E2的濃度很低，但在精液和睪丸網中的濃度高于女性血液濃度。睪丸內的E2是芳香化酶（CYP19）催化T 產 生，CYP19 存 在 于Leydig 細 胞、Sertoli細胞、精原細胞、精母細胞、長形精子細胞和精子的內質網中。目前的證據表明，主要是Leydig細胞產生E2，體外實驗Sertoli細胞亦能合成E2。CYP19基因突變男子有青春期發育，第二性征正常，睪丸小或隱睪，生精細胞缺如，無精子或精子密度顯著降低、死精子；T 水平正常或降低，E2水平＜1.5pg／ml（5.49pmol／L，正常范圍36.6～146.4pmol／L），LH 和FSH 水 平 升 高，LH 脈 沖 頻 率 增 高，E2補 充治療后，LH 水平回復正常，FSH 仍高于正常［33］。

雌激素有兩種受體，即ESR1（ERα）和ESR2（ERβ），屬于轉錄因子家族核受體，E2與受體結合后，誘導核轉錄反應。此外，E2亦介導以秒或分計算的快速反應，這種快速反應有三種方式：（1）配體與位于胞漿膜附近的ESR1和ESR2結合，ESR 位于胞漿膜的機制未明；（2）ESR1 的剪接變異型，即ESR1-46 和-36；（3）G 蛋 白 偶 聯 雌 激 素 受 體（GPER）或GPER30。這些快速反應的下游信號途徑包括MAPK、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、cAMP和細胞內鈣動員［34］。

在體外培養條件下，E2通過ESR1調節Sertoli細胞的增值。一方面激活GPER，上調BCL2／BCL2L2，保護細胞抵抗調亡；另一方面通過G-1-GPER／EGFP途徑下調BAX 表達，降低調亡風險。說明E2通過不同分子信號途徑的介導，維持精子發生過程中細胞增殖和調亡之間的平衡［35］。E2亦能迅速促進體外培養的精原細胞（GC-1 細胞系）的增殖［36］。

ESR1基因敲除雄鼠出生后睪丸正常，青春期后睪丸開始變性，成年期睪丸萎縮，精子發生障礙和精子密度顯著降低，并不育；ESR2基因第3外顯子缺失突變雄鼠由于受體后信號轉導阻斷，亦表現不育［34-36］。

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