HPLC-ELSD法同時測定心腦舒口服液中 7 種皂苷類成分

林 林， 劉廣楨， 劉洪超， 徐麗華

（山東省食品藥品檢驗所，山東 濟南 250101）

［質(zhì) 量］

HPLC-ELSD法同時測定心腦舒口服液中 7 種皂苷類成分

林 林， 劉廣楨， 劉洪超， 徐麗華

（山東省食品藥品檢驗所，山東 濟南 250101）

目的 建立同時測定心腦舒口服液 （人參、 黃芪、 五味子、 黨參、 麥冬） 中人參皂苷 Rg； 人參皂苷 Re； 人參皂苷 Rf； 人參皂苷 Rb1； 人參皂苷 Rb2； 人參皂苷 Rb3； 黃芪甲苷的方法。 方法 采用 HPLC-ELSD法； Kromasil C18色譜柱； 乙腈-水為流動相； 體積流量為 1mL/min。 結(jié)果 根據(jù)回歸方程， 7 種成分人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Re、 人參皂苷 Rf、 人參皂苷 Rb1、 人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3、 黃芪甲苷分別在 0.202 8 ～2.028 μg（ r=1.00）， 0.378 8 ～3.788 μg（r=1.00）， 1.686 2 ～16.862 μg（r=1.00）， 0.843 4 ～8.434 μg（r=1.00）， 0.204 8 ～2.048 μg（r= 1.00）， 0.181 6 ～1.816 μg（r=1.00） 和 0.116 6 ～1.166 μg（r=1.00） 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， 平均回收率分別為 98.1% （RSD為 1.1%）， 98.1% （RSD為 0.87%）， 98.5% （RSD為 0.58%），98.2% （RSD為 0.58%），98.6%（RSD為 0.49%），98.7% （RSD為 1.1%）， 98.5% （RSD為 0.42%）。 結(jié)論 該方法多種成分同時測定， 操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于心腦舒口服液的質(zhì)量控制。

心腦舒口服液； 人參皂苷 Rg1； 人參皂苷 Re； 人參皂苷 Rf； 人參皂苷 Rb1； 人參皂苷 Rb2； 人參皂苷 Rb3；黃芪甲苷

心腦舒口服液由人參、黃芪、五味子、黨參、麥冬五味藥組成，具有補氣養(yǎng)陰的作用，主要用于氣陰兩虛而致的頭暈?zāi)垦＃呓⊥募抡伲虤庵耄院贡I汗，不耐煩勞等癥。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于 《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 中藥成方制劑第 17冊，僅有人參中人參二醇、人參三醇的薄層鑒別項。為進一步提高該制劑的質(zhì)量控制，本實驗基于中藥配伍君臣佐使的基本原則，參考相關(guān)文獻［1-15］， 建立了心腦舒口服液中主要藥味人參、 黃芪中 7 種皂苷類成分人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3、 人參皂苷 Re、 人參皂苷 Rf和黃芪甲苷的同時測定方法。 通過方法學(xué)驗證，該方法操作簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為全面控制心腦舒口服液的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1200 高效液 相色譜 儀 （ 四元梯 度泵、自動進樣器、 蒸發(fā)光散射檢測器、 Agilent色譜工作站）， Mettler AE240 電子天平 （ 瑞 士 梅 特勒公司）； 黃芪甲苷對照品 （批號 110781-200613）、人參皂苷 Rg1對照品 （ 批號 110703-200424 ）、 人參皂苷 Rb1對照品 （批號 110704-200420）、 人參皂苷 Rb2對照品 （ 批號 111715-200501）、人參皂苷Rb3對照品 （批號 111686-200501）、 人參皂苷 Re對照品 （批號 110754-200421）、 人參皂苷 Rf對照品 （批號 111719-200502） 均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。心腦舒 口 服 液 （ 批 號 分 別 為： 120301、 120302、120303） 由榮昌制藥 （淄博） 有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條 件 Kromasil C18色譜 柱 （ 250 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 以乙腈為流動相 A， 水為流動相B， 梯度洗脫 （ 表 1）； 體積流量 1 mL/min， 柱溫35℃。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution mode ofmobile Phase

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷Rg1、 人參皂苷 Re、 人參皂苷 Rf、 人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3和黃芪甲苷對照品適量， 加甲醇制成質(zhì)量濃度 為 0.101 4、 0.189 4、 0.843 1、 0.421 7、 0.102 4、 0.090 8、 0.058 3 mg/mL的混合溶液， 作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品適量， 混勻，精密量取 10 mL， 置分液漏斗中， 加水 10 mL，用正丁醇振搖提取 4 次， 每次 20 mL， 合并正丁醇提取液， 用濃氨試液洗滌 2 次， 每次 30 m L， 棄去氨洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中， 加甲醇至刻度， 搖勻， 濾過，即得。

2.4 陰性溶液的制備 分別取不加黃芪、 人參的空白樣品，按供試品溶液的制備項下的方法，制得陰性對照溶液，即得。

2.5 方法的專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、 供試品溶液及陰性對照溶液各 5 μL， 按“2.1” 項色譜條件分析， 結(jié)果見圖 1。 人參皂苷Rg1、 人參皂苷 Re、 人參皂苷 Rf、 人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3和黃芪甲苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于 1.5， 拖尾因子在 0.90 ～1.10， 理論板數(shù)以各峰計均在 5 000 以上。陰性對照在相應(yīng)位置上未見色譜峰，心腦舒口服液中其他組分不干擾7種成分的測定，方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液，分別進樣 2、 5、 10、 15、 20 μL， 按 “2.1” 項色譜條件分析， 以進樣量 （C） 的對數(shù)值為橫坐標(biāo)， 峰面積 （A） 的對數(shù)值為縱坐標(biāo)， 進行線性回歸， 得到回歸方程。 人參皂苷 Rg1回歸方程為 ln A=1.23 ln C+5.64 （r=1.00）， 人參皂苷 Re回歸方程為ln A=1.61 ln C+4.56 （ r=1.00）， 人參皂苷 Rf回歸方程為 ln A=1.27 ln C+5.51 （ r=1.00）， 人參皂苷 Rb1回歸方程為 ln A=1.52 ln C+4.71 （ r= 1.00）， 人參皂苷 Rb2回歸方程為 ln A=1.21 ln C+ 6.34 （r=1.00）， 人參皂苷 Rb3回歸方程為 ln A= 1.20 ln C+6.44 （r=1.00）， 黃芪甲苷回歸方程為ln A=1.24 ln C+6.92 （r=1.00）。 結(jié)果表明人參皂苷 Rg1、 人 參 皂 苷 Re、 人 參 皂 苷 Rf、 人 參 皂 苷Rb1、 人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3和黃芪甲苷分別在 0.202 8 ～2.028 μg， 0.378 8 ～3.788 μg，1.686 2 ～16.862 μg， 0.843 4 ～ 8.434 μg，0.204 8 ～2.048 μg， 0.181 6 ～ 1.816 μg 和0.116 6 ～1.166 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗 取混合對照品溶液， 按 “2.1”項色譜條件分析， 連續(xù)進樣6次測定， 每次 5 μL，測定峰面積值， 結(jié)果人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Re、人參皂苷 Rf、 人參皂苷 Rb1、 人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3和 黃 芪 甲 苷的 RSD值分別為 0.86%、1.2%、 0.76%、 0.84%、 0.59%、 0.87%、1.2%， 表明精密度良好。

1.人參皂苷 Rg12.人參皂苷 Re 3.人參皂苷 Rf 4.人參皂苷 Rb15.人參皂苷 Rb26.人參皂苷 Rb37.黃芪甲苷1.ginsenoside Rg12.ginsenoside Re 3.ginsenoside Rf 4.ginsenoside Rb15.ginsenoside Rb26.ginsenoside Rb37.astragaloside

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液， 按 “2.1”項色譜條件，分別于 0、 3、6、9、12、 15 h 測定，結(jié)果人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Re、 人參皂苷 Rf、人參皂苷 Rb1、 人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3和黃芪甲苷的 RSD值分別為 0.78%、 1.4%、 0.86%、0.59%、 0.79%、0.74%、 0.78%，說明供試品中的7種指標(biāo)成分在室溫條件下15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批心腦舒口服液 （批號20120301）， 平行制備 6 份供試品溶液， 按 “2.1”項色譜條件分析， 結(jié)果人參皂苷 Rg1平均質(zhì)量濃度為 0.090 4 mg/mL， RSD為 0.76%； 人參皂苷 Re平均質(zhì)量濃度為 0.204 3 mg/mL， RSD為 1.1%；人參皂苷 Rf平均質(zhì)量濃度為 0.801 7 mg/mL， RSD為 0.71%； 人參皂苷 Rb1平均質(zhì)量濃度為 0.428 6 mg/mL， RSD為 1.0%； 人參皂苷 Rb2平均質(zhì)量濃度為 0.098 8 mg/mL， RSD為0.69%； 人參皂苷 Rb3平均質(zhì)量濃度為 0.098 1 mg/mL， RSD為 0.84%；黃芪甲苷平均質(zhì)量濃度為 0.062 9 mg/mL， RSD為0.89%。 結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收試驗 取心腦舒口服液 （批號20120301） 適量， 精密量取 6 份， 每份 5 mL， 置具塞錐形瓶中，分別精密加入 “2.2” 項下的對照品溶液 5 m L（含人參皂苷 Rg10.507 0 mg、 人參皂苷 Re 0.947 0 mg、人參皂苷 Rf 4.215 5 mg、 人參皂苷 Rb12.108 5 mg、 人參皂苷 Rb20.512 0 mg、人參皂苷 Rb30.454 0 mg和黃芪甲苷 0.291 5mg），制備供試品溶液， 進樣 5 μL， 按 “2.1” 項色譜條件分析。 回收率分別為 98.1%、 98.1%、 98.5%、98.2%、 98.6%、 98.7%、 98.5%， RSD 分 別 為1.1%、 0.87%、 0.58%、 0.58%、 0.49%、1.1%、 0.42%， 結(jié)果表明該方法的回收率良好。結(jié)果見表2。

2.11 樣品的測定 分別取 3 批心腦舒口服液樣品制成的供試品溶液各5 μL， 以及 “2.1”項下的對照品溶液 5 μL、10 μL、 15 μL注入液相色譜儀，測定，按外標(biāo)三點法對數(shù)方程進行計算。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 樣品測定結(jié)果顯示不同批次樣品中各待測成分的量存在較大差異，這可能與藥材質(zhì)量存在較大聯(lián)系，進一步提示測定該制劑中7種成分的必要性，對保證制劑的質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定可靠有著重要影響。

表 2 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）Tab.2 Results of recovery tests（n=6）

表3 心腦舒口服液中有效成分的測定結(jié)果 （n=3）Tab.3 Determ ination of active com Ponents in Xinnaoshu O ral Liquid（ n=3）

3.2 目前的文獻報道中僅有心腦舒口服液中人參皂苷 Rg1與人參皂苷 Re的定量測定， 本實驗將心腦舒口服液中人參中人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Rb2、 人參皂苷 Rb3、 人參皂苷 Re、 人參皂苷 Rf等 6 種成分和黃芪中黃芪甲苷共7 種成分的量進行同時測定。

3.3 在色譜條件的選擇中， 由于使用蒸發(fā)光檢測器，不能使用非揮發(fā)性的試劑，參考相關(guān)文獻，可選擇的流動相只有甲醇-水、 乙腈-水兩種， 綜合實驗結(jié)果， 以乙腈-水為流動相， 色譜行為更理想。

3.4 在供試品溶液的制備過程中， 曾考察過直接加水飽和的正丁醇提取與加水稀釋后用水飽和正丁醇提取，由于本品含糖量較高，加水稀釋后有利于萃取分層。

3.5 在供試品溶液的制備過程中， 正丁醇液的洗滌曾考察過濃氨試液、 氨試液以及1%氫氧化鈉溶液，由于黃芪甲苷在堿性環(huán)境中存在轉(zhuǎn)化的過程，綜合試驗結(jié)果以及操作過程，最后選擇以濃氨試液作為洗滌溶劑。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010.

［ 2 ］ 李紅月， 李 軍.心腦舒口服液中人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Re的含量測定［J］.黑龍江科技信息， 2011（15）： 24.

［3］ 鄭先華， 于 偉， 陳 樺.心腦舒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.云南中醫(yī)中藥雜志， 2006， 27（4）： 41-42.

［4］ 劉浩文，劉嘉儀.黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的兩種方法的比較 ［J］.中藥新藥與臨床藥理， 2011， 22 （6）：659-662..

［ 5 ］ 范 輝， 顧泉琳， 貝偉劍， 等.HPLC法測定烏參醒腦滴丸中人參皂苷 Rg1、 Re、 Rb1和 Rd ［J］.中成藥， 2012，34（8）： 1280-1283.

［ 6 ］ 劉 志， 阮長春， 劉天志， 等.HPLC法同時測定林下參、鮮人參、 生曬參和紅參中 14 種人參皂苷［J］.中草藥，2012， 43（7）： 2431-2434.

［ 7 ］ 曹樹萍， 聶黎行， 王鋼力， 等.HPLC法同時測定參麥注射液中 9 個人參皂苷的含量［J］.藥物分析雜志， 2011， 41（8）： 476-479.

［ 8 ］ 汪 冰， 尤慧蓮， 徐麗華.HPLC法測定芪參膠囊中五種成分的含量［J］.中成藥， 2012， 34（3）： 483-486.

［ 9 ］ 代 龍.HPLC法測定血塞通分散片中三七皂苷 R1及人參皂苷 Rg1、 Rb1的 含 量 ［ J］.齊 魯 藥 事， 2009， 28 （ 6 ）：333-335.

［10］ 刁保忠， 靳維榮， 王登旭， 等.RP-HPLC法測定生津益氣口服液中黃芪甲苷的含量［J］.齊魯藥事， 2012， 31（10）：588-589.

［11］ 陳祖云， 石凌云， 黃 勇， 等.HPLC-ELSD法測定腦通顆粒中黃芪甲苷和人參皂苷 Rb1的含量及穩(wěn)定性［J］.中國藥房， 2011， 22（23）： 2164-2166.

［12］ 馮向東， 黃海欣， 高光偉， 等.HPLC-ELSD測定心寧片中三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1的含量［J］.中成藥， 2007， 29（12）： 1786-1789.

［13］ 曹湘萍， 梁建寧， 何曉艷， 等.HPLC-ELSD法測定乙肝寧顆粒中黃芪甲苷的含量［ J］.中成 藥， 2005， 27 （2）：165-167.

［14］ 林 雅， 施 紅.HPLC-ELSD法測定石斛合劑中黃芪甲苷的含量［ J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2008， 18（1） ： 31-32.

［15］ 劉元媛， 張振秋.HPLC-ELSD測定康艾扶正片中黃芪甲苷的含量［J］.中成藥， 2007， 29（11）： 1705-1706.

Determ ination of seven saPonins in Xinnaoshu Oral Liquid by HPLC-ELSD

LIN Lin， LIU Guang-zhen， LIU Hong-chao， XU Li-hua
（Shandong Provincial Institute for Food and Drug Control， Jinan 250101， China）

AIM To develop amethod for determining seven kinds of saponins in Xinnaoshu Oral Liquid （ Astragali Radix， Ginseng Radix et Rhizoma， Schisandrae Chinensis Fructus， Codonopsis Radix，Ophiopogonis Radix）.METHODS The quantative analysiswas carried outon a column of Kromasil C18by HPLC-ELSD， using a mobile phase of acetonitrile-water under a flow rate of 1 m L/min.RESULTS The linear ranges of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Rf， ginsenoside Rb1， ginsenoside Rb2， ginsenoside Rb3and astragaloside fell within the ranges of 0.202 8-2.028 μg， 0.378 8-3.788 μg， 1.686 2-16.862 μg， 0.843 4-8.434 μg， 0.204 8-2.048 μg， 0.181 6-1.816 μg， 0.116 6-1.166 μg，respectively， The seven components showed good linear correlations（r=1.00， r=1.00， r=1.00， r=1.00， r=1.00， r=1.00， r=1.00） .The recoveries were 98.1%for ginsenoside Rg1， 98.1%for ginsenoside Re， 98.5%for ginsenoside Rf， 98.2%for ginsenoside Rb1， 98.6%for ginsenoside Rb2， 98.7%for ginsenoside Rb3， and 98.5%for astragaloside， respectively.The relative standard deviationswere 1.1%，0.87%， 0.58%， 0.58%， 0.49%， 1.1%， 0.42%，respectively（n=6 ）.CONCLUSION Thismethod is simple， accurate， reproducible and convenient for the quality control over Xinnaoshu Oral Liquid.

Xinnaoshu Oral Liquid； ginsenoside Rg1； ginsenoside Re；ginsenoside Rf；ginsenoside Rb1；ginsenoside Rb2； ginsenoside Rb3； astragaloside

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0090-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.022

2013-03-18

基鑫項目： 2013 年山東省自然科學(xué)基金 （ZR2013HM074）

林 林 （1980—） ， 女， 主管藥師， 碩士， 研究方向： 中藥分析。 Tel（0531） 81216523， E-mail： linlinsfda@163.com