丹參酮ⅡA誘導體外胃癌細胞的自噬

趙雪峰， 魏敬妙， 李 勇*， 張志棟， 賈 楠

（1.河北醫科大學第四醫院普外科， 河北 石家莊 050011； 2.河北醫科大學第四醫院肝膽外科， 河北 石家莊 050011）

丹參酮ⅡA誘導體外胃癌細胞的自噬

趙雪峰1， 魏敬妙2， 李 勇1*， 張志棟1， 賈 楠1

（1.河北醫科大學第四醫院普外科， 河北 石家莊 050011； 2.河北醫科大學第四醫院肝膽外科， 河北 石家莊 050011）

目的 探討丹參酮ⅡA體外對人胃癌 SGC7901 細胞自噬的影響， 初步探討其抑制腫瘤的機制。 方法 MTT法檢測不同質量濃度 （0.5、 1、 2 和 4 μg/mL） 丹參酮ⅡA作用體外培養的胃癌 SGC7901 細胞共孵 24、 48、 72 h 后， 細胞增殖活力的改變； 1、 2 和 4 μg/mL丹參酮ⅡA作用 SGC7901 細胞 48 h 后， 流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞自噬小體的水平； 實時定量 RT-PCR和 Western blot分別測定自噬相關蛋白 Beclin 1、 磷酸酯酶與張力蛋白同源物 （ PTEN） 、LC3-Ⅱ和 LC3-I的 mRNA和蛋白的表達水平。 結果 0.5 μg/mL丹參酮ⅡA對胃癌 SGC7901 細胞沒有明顯的生長抑制作用， 1 μg/mL以上各質量濃度丹參酮ⅡA對胃癌 SGC7901 細胞則有明顯的生長抑制作用； 流式細胞分析結果顯示， 與對照組相比， 丹參酮ⅡA誘導細胞凋亡 （P＜0.05）； 細胞內酸性自噬小體含量增加 （P＜0.05）； 實時定量 RTPCR和 Western blot結果顯示， 與對照組相比， Beclin-1、 PTEN和 LC3-ⅡmRNA和蛋白表達水平逐漸升高， LC3-I表達下降 （P＜0.05）。 結論 丹參酮ⅡA可誘導人胃癌 SGC7901 細胞自噬， 其機制可能涉及上調自噬相關基因表達Beclin-1， 促進自噬標志蛋白 LC3-I向 LC3-Ⅱ轉化， 促進自噬調控蛋白 PTEN表達。

丹參酮ⅡA；胃癌；自噬

KEY WORDS： tanshinoneⅡA； gastric cancer； autophagy

中醫學理論認為，“瘀血在經絡臟腑之間，結為癥瘕 （腫瘤）”， 基于腫瘤與血瘀證的關系， 臨床常采用丹參、當歸、莪術等活血化瘀藥進行抗腫瘤治療， 并取 得了良 好的療效［1］。 丹參 酮 ⅡA （tanshinoneⅡA， Tan ⅡA）是丹參 Salvia miltiorrhiza中提取的重要脂溶性單體成分之一，近年的研究表明，丹參酮ⅡA具有廣泛的抗腫瘤活性，可抑制細胞生長、 誘導凋亡和分化［2］。 自噬是細胞通過溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程。由于多腫瘤細胞均發生自噬活性的改變，因此，腫瘤治療中，以自噬為靶標的藥物的研發受到廣泛關注［3］。 丹參酮ⅡA對人胃癌細胞自噬作用的研究國內外尚未見報道。本實驗主要通過觀察丹參酮ⅡA對胃癌 SGC-7901 細胞自噬的影響， 探討其對胃癌抑制的作用機制。

1 材料和方法

1.1 藥物及試劑及主要儀器 SGC-7901 細胞為人胃癌細胞株，購自中國科學研究院上海細胞研究所。 胎牛血清、 RPMI 1640 細胞培養基、 胰蛋白酶， 購自美國 GIBCO公司； MTT和丹參酮ⅡA（ 純度 ＞99%） 購 自 Sigma公 司； 吖 啶 橙 購 自Sigma-Aldrich 公司， Beclin 1、磷酸酯酶與張力蛋白同源物 （ PTEN） 、 LC3-Ⅱ、 LC3-I和 β-actin 抗體購 自 Santa Cruz公 司； TRIzol試 劑 為 美 國 invitrogen 公司產品；逆轉錄試劑盒為 Promega公司產品； Real-Time PCR試 劑 盒 為 fermentas公 司 產品； 引物由上海生工生物技術公司合成。 Real-Time PCR儀為美國 ABI公司產品； Becton Dickinsor FACscan 流式細胞儀為美國 BD公司產品； 電泳和 轉 膜系 統 為 Bio-Rad 公 司 產 品； PVDF膜 為Millipore公司產品。

1.2 細胞培養 SGC-7901 細胞在含有 10%胎牛血清、 100 kU/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的 RPMI 1640 培養基中培養， 在含 5%CO2、 37 ℃條件下恒溫孵育。 每 3 天用含 0.02%EDTA的 0.25%胰蛋白酶溶液消化以1∶3的比例傳代。

1.3 MTT SGC7901 細胞以 5 ×103個/mL密度接種于 96 孔板，于 37 ℃和 5%的 CO2條件下培養24 h后， 用含有不同質量濃度的丹參酮ⅡA（0.5、1、 2、 4 μg/mL） 分別處理細胞 24、 48、 72 h， 對照組加入 0.1%DMSO。 每組設置 6 個復孔。 各實驗組于實驗結束前4 h 加入 20 μL的 MTT（質量濃度為 5 mg/mL）， 培養 4 h 后棄去培養液， 加入DMSO 150 μL于室溫振蕩 15 min 使結晶溶解， 酶標儀于490 nm處測光密度值 （OD值）， 以 OD值表示 SGC7901 細胞增殖能力。 以上實驗重復 3 次。

1.4 AnnexinV/PI流式細胞分析法檢測細胞凋亡5 ×103個/mL接種于 12 孔板中， 于 37 ℃和 5%的 CO2條件下培養24 h 后， 加入不同質量濃度的丹參酮ⅡA（1、 2 和 4 μg/mL）， 分別處理細胞 48 h，溶劑對照加入0.1%DMSO。 收集各組細胞 （包括培養基中的和貼壁的）， 用冷的 PBS 清洗 1 遍， 每管加入 500 μL結合緩沖液和 5 μL的 AnnexinV和 PI，室溫避光染色 5 min， 用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.5 細胞自噬小體的定量檢測 SGC-7901 細胞以5 ×103個/mL接種于 6 孔板， 于 37 ℃和 5%的CO2條件下培養 24 h， 用不同質量濃度的丹參酮ⅡA（1、 2 和 4 μg/m L） 分別處理細胞 48 h， 溶劑對照加入 0.1%DMSO，收集各組細胞， 用吖啶橙 （1 μg/mL） 室溫避光染色 20 min，離心后棄去染液， 用 1 ×PBS 清洗 3 次后， 再用 1 ×PBS 重懸細胞， 上流式細胞儀檢測熒光信號， FL1 通道檢測綠色熒光，FL3 通道檢測紅色熒光，以紅色熒光的強弱反映細胞內酸性自噬小體的多少。

1.6 總 RNA 提取及 Real-Time PCR SGC-7901細胞以 5 ×103個/mL接種于 6 孔板， 于 37 ℃和5%的 CO2條件下培養24 h， 用不同質量濃度的丹參酮Ⅱ A （1、 2、 4 μg/mL） 作用 SGC7901 細胞48 h， 溶劑對照加入 0.1%DMSO， 收集各組細胞，用 Trizol試劑提取各組細胞總 RNA， 紫外分光光度儀測定 RNA濃度及純度， 并經電泳鑒定后進行逆轉錄， 以 cDNA為 模板進行 Real-Time PCR 反應。以 GAPDH為內參照。

Beclin1 基因上游引物 5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′， 下游引物 5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTG G-3′。 LC3-I上 游 引 物 5′-TCCCGGACCATGTCAACAT-3′； 下 游 引 物 5′-ACCATGCTGTGCTGGTTCAC-3′。 LC3-Ⅱ上游引 物 5′-ACCATGCCGTCGGAGAAG-3′；下游引物 5′-ATCGTTCTATTATCACCGGGATTTT-3′。 PTEN上游引物 5′-TCACCAACTGAAGTGGCTAAAGA-3′； 下游引物 5′-CTCCATTCCCCTAACCCGA-3′。 GAPDH 上 游 引物 5′-GTAAAGACCTCTATGCCATCA-3′； 下 游 引 物 5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。

根據實時熒光定量擴增曲線獲取目的基因和內參基 因 的 Ct值， 以 目 的 基 因 Beclin 1、 PTEN、LC3-Ⅱ和 LC3-I表達的相對定量值 （RQ值） 進行統計學分析。1.7 Western blot檢測自噬相關分子的蛋白水平SGC-7901 細胞以 5 ×103密度接種于 6 孔板， 于 37℃和5%的 CO2條件下培養24 h， 用不同質量濃度的丹參酮ⅡA（1、 2 和 4 μg/mL） 作用 SGC7901 細胞 48 h， 溶劑對照加入 0.1%DMSO，收集各組細胞， 用 裂 解 緩 沖 液 （50 mmol/L Tris pH 7.2， 1% Triton X-100， 0.5% 脫氧膽酸 鈉， 0.1% 十二烷基硫 酸 鈉 ， 500 mmol/L NaCl， 10 nmol/L MgCl2， 10 mg/mL亮 抑 蛋 白 酶 肽， 10 mg/mL 抑 肽 酶， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟） 裂解整個細胞， 細胞總蛋白經 10%SDS-PAGE分 離 后 轉 到 PVDF膜 上。PVDF膜在5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h， 各目標分子特異性一抗4℃過夜，接著，用辣根過氧化酶標記的相應的二抗室溫孵育 2 h。 ECL法檢測結合的目的條帶。 以磷酸生油醛脫氫酶 （GAPDH） 作為內參 照， 用 目 的 蛋 白 Beclin 1、PTEN、 LC3-Ⅱ 和LC3-I光密度值/內參照光密度值的比值進行比較。1.8 統計學方法 計量資料以表示， 采用SPSS 13.0 統 計 分 析 軟 件 進 行 單 因 素 方 差 分 析 和Dunnett檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA抑制 SGC7901 細胞增殖 丹參酮ⅡA（0.5、 1、 2 和 4 μg/m L） 作用 SGC7901 細胞 24、 48、72 h 后， 與 對 照 組 相 比， 1、2、4 μg/mL丹參酮ⅡA對胃癌細胞以質量濃度和時間依賴的方式抑制細胞增殖 （P＜0.05）。 結果見表 1。

2.2 丹參酮ⅡA誘導 SGC7901 細胞凋亡 丹參酮ⅡA （1、 2、 4 μg/mL） 作 用 SGC7901 細 胞 48 h后，流式細胞分析結果顯示，與溶劑對照組細胞凋亡率相比，各質量濃度丹參酮ⅡA明顯誘導細胞凋亡 （P＜0.05）。 結果見表 2。

表1 丹參酮ⅡA對 SGC7901 細胞增殖的影響 （， n=6）Tab.1 Effect of TanⅡA to Proliferation for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

表1 丹參酮ⅡA對 SGC7901 細胞增殖的影響 （， n=6）Tab.1 Effect of TanⅡA to Proliferation for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

注： 與對照組比較，*P＜0.05； 與同組 24 h 比較，#P＜0.05；與同組48 h 比較，ΔP＜0.05

組 別 24 h 48 h 72 h對照組 1.02 ±0.18 1.04 ±0.16 1.01 ±0.15 0.5 μg/mL丹參酮 ⅡA 0.94 ±0.16 0.87 ±0.14 0.85 ±0.13 1 μg/mL丹參酮ⅡA 0.77 ±0.13*0.63 ±0.11* 0.56 ±0.07*#2 μg/mL丹參酮ⅡA 0.62 ±0.08*0.52 ±0.06*# 0.44 ±0.06*#Δ4 μg/mL丹參酮ⅡA 0.53 ±0.07*0.42 ±0.06*# 0.32 ±0.05*#Δ

表 2 丹參酮ⅡA對 SGC7901 細胞細胞凋亡率、 自噬小體的影響 （， n=6）Tab.2 Effect of TanⅡA to aPoPtosis for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

表 2 丹參酮ⅡA對 SGC7901 細胞細胞凋亡率、 自噬小體的影響 （， n=6）Tab.2 Effect of TanⅡA to aPoPtosis for gastric cancer cells line SGC7901 （， n=6）

注： 與對照組比較，*P＜0.05

組 別 細胞凋亡率/% 自噬小體 /%對照組 2.92 ±0.35 4.16 ±0.64 1 μg/m L丹參酮ⅡA 8.73 ±1.51* 9.77 ±1.92*2 μg/m L丹參酮ⅡA 12.24 ±2.27* 13.28 ±2.95*4 μg/m L丹參酮ⅡA 15.39 ±3.15* 16.54 ±3.28*

2.3 丹參酮ⅡA促進 SGC7901 細胞生成酸性自噬小體 與溶劑對照組酸性自噬小體的比例相比，丹參酮ⅡA組酸性自噬小體的比例明顯增加 （P＜0.05）， 表明丹參酮ⅡA可誘導 SGC7901 細胞自噬。結果見表2。

2.4 丹參酮ⅡA對 SGC7901 細胞自噬相關蛋白表達的影響 為了進一步觀察丹參酮ⅡA對 SGC7901細胞自 噬 影響的 機 制，通過 real-time RT-PCR和Western blot對 自 噬 相 關 蛋 白 Beclin-1、 PTEN、LC3-I和 LC3-ⅡmRNA和蛋白水平進行了檢測， 結果表明， 與對照組相比， 丹參酮ⅡA作用 SGC7901細胞 48 h 后， Beclin-1、 PTEN和和蛋白表達水平逐漸 升 高， LC3-I表 達 下 降，除 1 μg/mL丹 參酮ⅡA組 LC3-ⅡmRNA外， 其他差異均有統計學意義 （P＜0.05）。 結果見表 3， 表 4， 圖 1。

表 3 丹 參酮ⅡA對 SGC7901 細胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ 和 LC3-I m RNA的影響 （， n=3）Tab.3 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I m RNA in gastric cancer cells line SGC7901（， n=3）

表 3 丹 參酮ⅡA對 SGC7901 細胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ 和 LC3-I m RNA的影響 （， n=3）Tab.3 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I m RNA in gastric cancer cells line SGC7901（， n=3）

注： 與對照組比較，*P＜0.05

組 別 LC3-Ⅰ Beclin-1 PTEN LC3-Ⅱ對照組 1.20 ±0.20 1.07 ±0.13 1.07 ±0.14 1.10 ±0.13 1 μg/mL丹參酮ⅡA 0.77 ±0.16*1.64 ±0.20*1.65 ±0.20*1.07 ±0.13 2 μg/mL丹參酮ⅡA 0.53 ±0.16*3.34 ±0.61*3.35 ±0.62*1.82 ±0.32*4 μg/mL丹參酮ⅡA 0.34 ±0.01*4.59 ±0.76*3.72 ±0.78*2.36 ±0.41*

表 4 丹 參酮ⅡA對 SGC7901 細胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ和 LC3-I 蛋白的影響 （， n=3）Tab.4 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I Protein in gastric cancer cells line SGC7901 （， n=3）

表 4 丹 參酮ⅡA對 SGC7901 細胞 Beclin 1、 PTEN、 LC3-Ⅱ和 LC3-I 蛋白的影響 （， n=3）Tab.4 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ，LC3-I Protein in gastric cancer cells line SGC7901 （， n=3）

注： 與對照組比較，*P＜0.05

組 別 LC3-Ⅰ Beclin-1 PTEN LC3-Ⅱ對照組 1.12 ±0.16 0.37 ±0.05 0.26 ±0.04 0.31 ±0.03 1 μg/mL丹參酮ⅡA 0.71 ±0.11*0.62 ±0.12*0.55 ±0.08*0.48 ±0.06*2 μg/mL丹參酮ⅡA 0.55 ±0.09*0.71 ±0.11*0.69 ±0.12*0.65 ±0.11*4 μg/mL丹參酮ⅡA 0.44 ±0.01*0.85 ±0.13*0.97 ±0.18*0.86 ±0.14*

圖 1 丹參 酮 ⅡA對 SGC7901 細 胞 Beclin 1、 PTEN、LC3-Ⅱ和 LC3-I蛋白的影響Fig.1 Effect of TanⅡ A to Beclin 1， PTEN， LC3-Ⅱ ， LC3-I Protein in gastric cancer cells line SGC7901 （， n=3）

3 討論

近年研究發現一些中國傳統中藥具有明顯的抗腫瘤活性。已有研究證實，丹參酮ⅡA是具有廣泛抗癌作用的新型抗癌中藥單體，可抑制等多種癌細胞生長。丹參酮ⅡA可通過抑制胃癌細胞增殖促進凋亡抑制胃癌生長［4-5］， 但對胃癌自噬的影 響未見報道。自噬對于細胞存活而言可謂是把雙刃劍，一方面當細胞在機體出現感染或者缺氧等應激刺激時，自噬會保護細胞使其存活，如果應激持續時間太長，則可出現自噬性細胞死亡。可見，細胞發生自噬有可能促進生長也有可能抑制細胞生長。因此，若能有效調控自噬，將對癌癥治療和退行性疾病的療效有很大提高［6］。

本實驗首先觀察了丹參酮ⅡA對胃癌細胞株SGC7901 增殖和凋亡的影響， 與報道一致， 本實驗也發現丹參酮ⅡA可抑制細胞生長促進其凋亡。有報道表明，某些抗腫瘤藥物在促進凋亡的同時會促進細胞自噬［7-8］。 自噬的 重要特征是胞質內 大量的酸性自噬小體形成，這些酸性自噬小體吞噬了細胞質和 （或） 細胞器后， 經過吖啶橙染色呈現出亮紅色熒光，且熒光強度可反映酸性自噬小體的酸度和 （或） 容積。本實驗通過流式細胞儀檢測紅色熒光的強度， 初步證實了丹參酮ⅡA作用 SGC7901細胞后，細胞自噬增加。

自噬是受一系列自噬相關基因調控的，比如Beclin 1 基因是研究較多的自噬相關基因， 可通過促進自噬抑制腫瘤的生長，是候選的腫瘤抑制基因［5］。 有研究發現胃癌組織中 Beclin 1 的陽性表達率低于正常組織， 且 Beclin 1 的蛋白表達水平與胃癌分化程度有關［9］。 最近有人認為 Beclin 1 可作為有淋巴結轉移的胃癌患者生存時間的預測因子［10］。PTEN是已知的抑癌基因， 可使細胞自噬開啟， 研究表明 PTEN的突變 可 抑制自噬［11-12］； 而且 PTEN的陽性表達率與胃癌組織的分化程度、浸潤深度、淋 巴 轉 移 呈 正 相 關［6］。 因 此， 認 為 Beclin 1 和PTEN高表達可促進胃癌自噬， 本實驗的結果也表明， 丹參酮ⅡA作用后， Beclin 1 和 PTEN的表達隨著質量濃度增加逐漸升高。

LC3， 即微管相關蛋白 1 輕鏈 3，酵母自噬相關蛋白8在哺乳動物的同源類似物，是目前自噬的唯一標志蛋白［13-14］。 LC3 有兩種存在形式： LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ［15］， 自 噬 發 生 時， LC3-Ⅰ 可 轉 化 形 成LC3-Ⅱ，二者的水平和比值可以反應細胞自噬活性。 通過實時定量 PCR和 Western blot分析， 發現丹參酮ⅡA作用后 LC3-ⅡmRNA和蛋白表達水平逐漸 升 高， LC3-Ⅰ 表 達 下 降， 出 現 LC3-Ⅰ 向LC3-Ⅱ的轉化， 此結果提示丹參酮ⅡA可促進胃癌自噬，其具體機制值得進一步探索。

綜上所述，丹參酮ⅡA可通過促進自噬相關基因 Beclin 1、 PTEN和 LC3-Ⅱ的表達促進細胞自噬。然而，由于自噬在腫瘤的作用及機制還存在較大爭議以及自噬的復雜性，需要進行更深入的研究以明確丹參酮ⅡA對胃癌自噬的影響。

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TanshinoneⅡA induces autoPhagy of human gastric cancer SGC7901 cells line in vitro

ZHAO Xue-feng1， WEI Jing-miao2， LIYong1*， ZHANG Zhi-dong1， JIA Nan1
（1.Departmentof General Surgery， The Fourth Hospital Affiliated to HebeiMedical University， Shijiazhuang 050011， China； Departmentof Hepatobiliary Surgery， The Fourth Hospital Affiliated to HebeiMedical University， Shijiazhuang 050011， China）

AIM To investigate the effect of tanshinoneⅡ A （ Tan Ⅱ A） on the autophagy of human gastric cancer SGC7901 cells and possible mechanism.M ETHODS SGC7901 cells were cultured in vitro and incubated with different concentrations（0.5， 1， 2， 4 μg/m L） TanⅡA in different time（24， 48， 72 h）.MTT assay was developed to detect the cell proliferation.The cell apoptotic rate and the content of acidic vesicular organelles contentwere detected by flow cytometry in 48 h.The expressions of autophagy-associated protein Beclin 1， phosphatase and tensin homolog（PTEN）， LC3-I and LC3-Ⅱ were detected by real-time RT-PCR and western blot. RESULTS TanⅡA（0.5 μg/mL） had no significant effect on proliferation of SGC7901 cells compared to DMSO group （ P＞0.05 ） .Tan Ⅱ A showed a dose-and time-dependent growth inhibition at the concentration above 1 μg/mL（P＜0.05） .Compared with DMSO group， the cell apoptotic rate and content acid vesicular organelles content increased with the treatment of Tan ⅡA.The results of real-time RT-PCR and western blot showed that compared with DMSO group， the expressions of Beclin 1， PTEN and LC3-Ⅱ were significantly up-regulated aswell as the experssion of LC3-Iwas significantly down-regulated （P＜0.05）.CONCLUSION Tan ⅡA induces the auophagy of human gastric cancer SGC7901 cells in time-and dose-dependentmanner in vitro， whichmay be related to the up-regulation of Beclin 1， PTEN and LC3-Ⅱ， as well as down-regulation of LC3-I.

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0010-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.003

2013-02-18

趙雪峰 （ 1976—）， 男， 副 主 任 醫 師， 博 士， 從 事 消 化 道 腫 瘤 的 臨 床 與 基 礎 研 究。 Tel： 13933012139， E-mail： xuexuexue1976@126.com

*通信作者： 李 勇 （1958—）， 男， 教授， 主任醫師， 博士生士師， 博導， 從事消化道腫瘤的臨床與基礎研究。 Tel： 13931116966