6 種中藥活性成分對 K562/ADM 耐藥性逆轉及 P27 和 P170 蛋白表達影響

陳 超， 蔡天革， 張榮華， 楊 麗， 蔡 宇*

（1.暨南大學附屬第一醫院， 廣東 廣州 510630； 2.遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110036；3.暨南大學藥學院， 廣東 廣州 510632）

［藥 理］

6 種中藥活性成分對 K562/ADM 耐藥性逆轉及 P27 和 P170 蛋白表達影響

陳 超1， 蔡天革2， 張榮華3， 楊 麗3， 蔡 宇3*

（1.暨南大學附屬第一醫院， 廣東 廣州 510630； 2.遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110036；3.暨南大學藥學院， 廣東 廣州 510632）

目的 觀察中藥活性成分對白血病 K562/ADM耐藥細胞逆轉及 P27 和 P170 蛋白表達的影響， 探討其可能作用機制。方法 選用補骨脂素、 苦參堿、 槲皮素、 姜黃素、 川芎嗪、 大黃酸6種中藥單體成分作為研究對象， MTT比色法測定 6 種中藥成分對 K562/ADM耐藥細胞的增殖抑制作用， 高效液相色譜法檢測細胞內阿霉素的質量濃度， 流式細胞術檢測 K562/ADM耐藥細胞中 P27 和 P170 蛋白表達。 結果 6 種中藥活性成分逆轉耐藥倍數在 6.99 ～10.59 之間，K562/ADM耐藥細胞中阿霉素積累比率為 （11.6 ±3.7） ～ （17.7 ±2.8）； 對照組 P27 和 P210 蛋白的表達率分別為（33.1 ±2.1） 和 （6.51 ±1.33）， K562/S 和 K562/ADM耐藥細胞的 P27 和 P210 相關蛋白表達率分別在 （54.2 ±3.5）～ （72.1 ±4.2） 和 （6.21 ±1.35） ～ （ 6.59 ±1.48） 之間。 結論 6 種中藥活性成分具有不同程度的逆轉耐藥細胞作用， 且影響耐藥細胞內化療藥物質量濃度； 各中藥活性成分具有不同程度抑制 K562/ADM耐藥細胞中 P27 蛋白表達作用。

補骨脂素； 苦參堿； 槲皮素； 姜黃素； 川芎嗪； 大黃酸； K562/ADM耐藥細胞； P27； P170； 蛋白表達

化學藥物是治療白血病方法之一，但由于白血病細胞的耐藥性，常限制化療療效，并導致治療失敗。白血病藥物多藥耐藥機制形成較復雜，目前雖探討較多但還 未 完全明晰［1-3］； 本 實 驗選用 K562/ ADM耐藥細胞株為研究對象， 開展中藥活性成分對其耐藥逆轉影響評價以及其對耐藥細胞內化療藥物濃度影響，探索其對耐藥細胞 P27 和 P170 蛋白表達影響以說明其作用機制。

1 實驗材料

選取白血病 K562/S （敏感株） 和 K562/ADM（耐藥阿霉素 K562 細胞株）， 購買于中山大學實驗動物中心； 小牛血清及 RPMI-1640 培養液由 GIBCO公司出品， 批號 20120320； 破膜液 A和 B由北京阜康生物科技股份有限公司生產，批號20120122。 選擇 6 種中藥活性成分 （補骨脂素、 川芎嗪、苦參堿、姜黃素、槲皮素、大黃酸）做為實驗受試物， 受試物純度 99.9%， 于中國食品藥品檢定研究院購買的對照品。參考以往實驗結果和報道受試物的使用質量濃度為 30 μg/mL［4-5］。

2 實驗方法

2.1 各受試物對白血病細胞增殖抑制作用 對數生長期的 K562/S 和 K562/ADM耐藥細胞數分別以0.5 ×105個/mL和 1 ×105個/mL接種于細胞培養板， 在 37 ℃、 5%CO2培養條件下 100 μL/孔接種12 h 后， 分別加入上述受試物和阿霉素共 100 μL，在調零組和對照組分別加相應體積的培養液，除調零組外，細胞培養 72 h 后加 5 mg/mLMTT 20 μL，再培養4 h，傾出培養液，加 DMSO 100 μL/孔， 溶解后用酶標儀 （奧地利 TZCAN公司生產） 讀取吸光度 A值 （波長570 nm）， 取 A值均數按公式計算細胞抑制率， 并求出半數抑制質量濃度 （ IC50），實驗重復 3 次， 逆轉耐藥倍數 =K562/ADM耐藥株對照組 IC50/用藥組 IC50。

2.2 高效液相色譜法檢測細胞內阿霉素質量濃度參考文獻 ［6］ 實驗方法， 取對數生長期白血病K562/S 敏感株和 K562/ADM耐藥細胞株， 在培養液中分別加或不加 30 μmol/L的各中藥單體成分補骨脂素、苦參堿、槲皮素、姜黃素、川芎嗪、大黃酸， 再加 5 mg/L的阿霉素， 培養3 h 后收集細胞，PBS 洗滌重懸計數后置 -20 ℃冰箱保存， 測定前先溶化并超聲處理， 離心 30 min， 取上清進樣高效液相色譜 （ 安捷倫 1100 型）； 色譜 C18柱， 流動相為 55%乙腈， 體積流量 1 mL/min， 柱溫 35 ℃， 檢測波長 290 nm，取樣 10 μL進樣分析。 以阿霉素對照品為內標，色譜峰的峰面積對阿霉素的質量濃度進行線性回歸， 其線性回歸曲線為 y=0.081x+ 0.31 （r=0.996， n=5）； 細胞內阿霉素積累比率 =合用中藥活性成分細胞內阿霉素質量濃度/單用阿霉素后細胞內阿霉素質量濃度。

2.3 流式細胞術測定耐藥細胞 P27 和 P170 蛋白表達 采用 PBS 液重懸白血病 K562/ADM 耐藥細胞， 細胞數為 1 ×106個/mL，取 50 μL細胞液加入 100 μL破膜液 A后，加入 2mL PBS， 離心后棄上清， 加 100 μL破膜液 B及 RD公司抗體 P27（SC-1641） 和 AB-CAM公司 P170 抗體 （110917）5 μL， PBS 液 洗滌 離 心 后加 入 5 μL FITC標 記 二抗， 反 應 15 min 后 PBS 液 洗 滌 離 心， 450 μL 1%多聚甲醛固定 30 min 后， 上 機流式細 胞 儀 （ 美 國BD公司） 檢測。

3 實驗結果

3.1 各受試物對白血病 K562/ADM耐藥的細胞毒作用 6 種受試中藥活性物的質量濃度為 30 μg/mL， 與阿霉素合用對白血病 K562/ADM耐藥株的 IC50在 45.6 ～69.9 ng/mL之間， 相應 K562/S敏感株的 IC50在 4.7 ～7.9 ng/mL范圍， 實驗結果見下表1。

表1 受試物的細胞毒作用Tab.1 Cytotoxicity of each trail drug

3.2 各受試物對 K562/ADM耐藥細胞內阿霉素質量濃度和 P27、 P170 蛋白表達影響 各受試物對K562/ADM耐藥細胞的逆轉倍數在 6.99 ～10.59 之間， K562/ADM 耐 藥 細 胞 中 阿 霉 素 積 累比 率 在（11.6 ±3.7） ～ （17.7 ±2.8） 之間；對照組 P27和 P210 蛋白表達率百分比分別為 （33.1 ±2.1） 和（6.51 ±1.33），相應 K562/ADM耐藥細胞 P27 和P210 相 關 蛋 白 表 達 率 分 別 為 （54.2 ±3.5） ～（72.1 ±4.2） 和 （6.21 ±1.35） ～ （ 6.59 ±1.48）之間， 結果見表2 ～4。

表 2 各中藥成分對 K 562/ADM 耐藥細胞內阿霉素積累比率和逆轉倍數影響Tab.2 Influence of herb's active constituents on accumulation and reversal rates of adriam ycin in K562/ ADM strain

表 3 各中藥成分對 K 562/ADM 耐藥細胞內 P27 蛋白表達影響Tab.3 Influence of herb's active constituents on K562/ ADM cells and exPression of P27

表 4 各中藥成分 對 K562/ADM 耐藥 細 胞內 P170 蛋白表達影響Tab.4 Influence of herb's active constituents on K562/ADM drug resistance strain and exPression of P170

4 討論

白血病細胞對化療藥物的多重耐藥是導致化療失敗的常見因素，目前認為多種作用機制是白血病細胞多重耐藥形成原因， 包括細胞膜 P-糖蛋白 （P-gP）、多藥耐藥相關蛋白 （MRP） 過度表達形成藥物外輸泵， 使化療藥物在白血病細胞內濃度下降［7-9］。

近年來，細胞信號傳導通路成為多重耐藥形成機制研究熱點， 其中 PI3K/Akt（phosphatidylinositol-3’ kinase/Akt） 是體內重要的信號轉導通路之一，在維持細胞的正常生理功能如生長、分化、代謝等方面起著關鍵作用， PI3K/Akt與腫瘤的 發生有些密切的關系，其中在某些白血病細胞中其表現為持續性 的 活化［10-11］。 PI3K/Akt信 號通路的 激 活可引起一系列的生物效應，如凋亡效應、調節細胞周期、 促進侵襲和轉移、 促進血管形成等， PI3K/ Akt信號通路主要通過磷酸化作用激活，活化的Akt還與細胞周期有關， 活化的 Akt使 P27 蛋白表達迅速下降， P27 蛋白是 CDK2 （ cyclin-de-pendent kinase2） 的抑 制 劑， 是一種細 胞 周 期調 節 激 酶，在調節細胞 進 入 S 期 中起 抑 制 作用［12-13］；本 實 驗數據表明， K562/ADM 耐藥細胞 P27 蛋白表達較K562/S 明顯降低， 同時各受試物能提高 P27 蛋白的表達率，因而也提示各受試物具有逆轉耐藥作用可能通過影響 PI3K/Akt信號轉導途徑而達到的。

P170 是多藥耐藥基因產物， 是多藥耐藥基因編碼的跨膜蛋白，是導致細胞產生多重耐藥的原因之一， 具有 ATP酶活性及其轉運功能， 可將化療藥物從細胞內排出，達到細胞內化療濃度降低，改善白血病細胞對化療藥物耐藥［14］， 本研究結果中K562/ADM耐藥細胞的 P170 高表達， 說明了 P170對耐藥形成的意義； 通過不同受試物對 K562/ADM耐藥細胞的 P170 蛋白表達率影響結果看，苦參堿、姜黃素和川芎嗪各組與對照組比較具有非常顯著性差異 P＜0.01， 而其他幾種受試物對 K562/ADM耐藥細胞的 P170 蛋白影響不明顯，同時與耐藥逆轉作用呈非正相關，就 P170 蛋白表達是否為其作用機制因素之一還有待今后進一步深入分析。

本實驗是以往就補骨脂素、補骨脂甲素、姜黃素、槲皮素、大黃酸等中藥活性成分對 K562 和 HL-60白血病細胞及其耐藥細胞影響的確切結果基礎上開展的［2，15］， 以往的結果給本實驗提供了劑量依據，本實驗也進一步開展了其他中藥活性成分研究，實驗結果也提示了具有逆轉耐藥作用的不同中藥活性成分對 P27 和 P120 蛋白影響規律并不完全一致， 該結果對探索不同中藥活性成分對 PI3K/Akt信號通路影響及其作用靶點和機制研究提供基礎，其具體其他可能機制有待進一步研究探討說明。

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Influences of six herbal constituents on Protein exPressions of P27 and P170 and reversal of K 562/ADM cells

CHEN Chao1， CAITian-ge2， ZHANG Rong-hua3， YANG Li3， CAIYu3*
（1.The First Affiliated Hospital to Jinan University， Guangzhou 510630， China； 2.School of Life Science of Liaoning University， Shenyang 110036，China； 3.School of Pharmacy of Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AIM To observe the influence of six herbal constituents， including psoralen，matrine， quercetin，curcumin igustrazine and rhein， on leukemia K562/ADM cells reversion and P27 and P170 protein expressions. M ETHODS MTT colorimetric was used to determine proliferation inhibition of six constituents on K562/ADM cells.HPLCmethod was used to detect the concentration ofadriamycin in the cells， and flow cytometrywasapplied to detecting P27 and P170 protein expression of K562/ADM cells.RESULTS The reverse ratio of drug resistance fell within 6.99 to 10.59， adriamycin accumulation in K562/ADM cells in multiples of（ 11.6 ±3.7 ） ～（17.7 ±2.8）， and P210 and P27 protein expression rate of control groups reached （33.1 ±2.1） and （6.51 ± 2.1）.K562/S， K562/ADM cells’ P27 and P210 related protein expression rates were in the range of（54.2 ± 3.5）to（72.1 ±4.2）and （6.21 ±1.35） to（6.59 ±1.48）.CONCLUSION Six herbal constituents have different abilities to reverse drug resistant cell function， to influence on chemotherapy drug concentration in the cell，and to inhibit P27 protein expression in K562/ADM.

psoralen；matrine； quercetin； curcumin igustrazine；rhein； K562/ADM； P27； P170； protein expression

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.001

2013-02-19

國家自然科學基金資助 （81072763）

陳 超 （1972—）， 男， 碩士， 主治醫師， 從事中藥藥效基礎與臨床研究。

*通信作者： 蔡 宇 （1972—） ， 男， 博士， 教授， 從事腫瘤多藥耐藥研究。 E-mail： caitiange@163.com