兔頸動(dòng)脈外膜剝離血管出血的動(dòng)物模型

秦丹丹　萬(wàn)圣云　丁洋　詹焱青

[摘要] 目的 建立一個(gè)穩(wěn)定的血管外膜剝離出血的動(dòng)物模型，用于臨床進(jìn)一步研究局部止血藥物的效果。 方法 取健康新西蘭大白兔12只，隨機(jī)按膠原酶濃度分為1 g/L、2 g/L、4 g/L三組，膠原酶消化兔頸動(dòng)脈至動(dòng)脈外膜疏松，眼科鑷鈍性剝離外膜，在剝離過(guò)程中出現(xiàn)血管滲血，觀察對(duì)比不同濃度膠原酶消化后動(dòng)脈出血量的變化，并取消化前后的頸動(dòng)脈行HE染色，光鏡下觀察外膜剝離程度，以確定膠原酶最佳消化濃度及剝離程度。 結(jié)果 1g/L的膠原酶消化動(dòng)脈外膜不徹底，無(wú)法造成動(dòng)脈穩(wěn)定的出血，4 g/L的膠原酶導(dǎo)致血管消化過(guò)度破裂出血，2 g/L的膠原酶消化血管外膜+眼科鑷鈍性剝離可使血管外膜剝離徹底，血管出血穩(wěn)定。 結(jié)論 膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜的方法可建立穩(wěn)定的血管出血模型，其最佳消化濃度為2 g/L。

[關(guān)鍵詞] 膠原酶；兔頸動(dòng)脈；外膜剝離；血管出血模型

[中圖分類號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）08-0001-03

目前臨床上局部止血藥物較多[1，2]，效果不一，臨床上對(duì)止血藥物效果的評(píng)估缺乏一種理想的出血模型，Kunio等[3]、Rall等[4]采用外科手術(shù)直接損傷動(dòng)脈，導(dǎo)致血管破裂，出現(xiàn)不可控制的出血，牟華明等[5]曾采用刀片刮除的方法去除兔頸動(dòng)脈外膜，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)刀片刮除外膜對(duì)血管牽張作用強(qiáng)，導(dǎo)致血管壁破裂出血，無(wú)法計(jì)量統(tǒng)計(jì)。本研究即嘗試建立一個(gè)穩(wěn)定的出血模型，用以對(duì)臨床上應(yīng)用的局部止血藥物效果進(jìn)行評(píng)估，以指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康新西蘭大白兔12只，雌雄各半，體重2.5～3.0 kg（由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物凝血功能正常，活動(dòng)不受限制，自由飲水，單籠常規(guī)喂養(yǎng)。試劑器材：Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），眼科鑷，電子天平，石蠟切片機(jī)，材料來(lái)源、層次相同的10 mm×6 mm干紗條若干。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組：1g/L膠原酶組、2 g/L膠原酶組、4 g/L膠原酶組，每組各4只。

1.2.2動(dòng)物模型建立 取3%戊巴比妥鈉1 mL/kg 沿兔耳緣靜脈靜推麻醉動(dòng)物。麻醉滿意后，動(dòng)物取仰臥位，頭部及四肢固定于手術(shù)臺(tái)上。頸前脫毛后常規(guī)碘酒、酒精消毒3遍，鋪洞巾，縱行切開皮膚，逐層分離頸部筋膜及肌肉，暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈鞘，仔細(xì)游離出雙側(cè)頸動(dòng)脈，長(zhǎng)約25 mm，用長(zhǎng)25 mm、寬15 mm的膠皮片放置于頸動(dòng)脈下端，隔開頸動(dòng)脈和周圍組織，用干紗條迅速擦凈周圍滲出液，采用不同濃度Ⅱ型膠原酶浸濕的紗條外敷左側(cè)頸總動(dòng)脈，共10 min，生理鹽水沖洗、中止消化，用眼科鑷剝離外膜白色疏松組織，直至白色疏松組織消失。用干紗條迅速擦凈周圍滲出液，然后將稱重好的干紗條包裹頸動(dòng)脈，稱重三組出血60 s的出血量，迅速用生理鹽水沖洗、干紗條擦凈后，再次稱重三組出血60 s的出血量，反復(fù)3次，并統(tǒng)計(jì)出血量。另一側(cè)頸動(dòng)脈不予膠原酶消化處理，僅放置長(zhǎng)25 mm、寬15 mm的膠皮片于頸動(dòng)脈下端，迅速用干紗條擦凈周圍滲出液，同樣方法放置干紗條稱重3次出血60 s的出血量，作為陰性對(duì)照側(cè)。

1.2.3取材及固定 稱重結(jié)束后立即取出雙側(cè)頸動(dòng)脈，標(biāo)本截取3段，迅速浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h以上，石蠟包埋固定切片。

1.3組織形態(tài)學(xué)觀察

標(biāo)本石蠟包埋后切片，切片按常規(guī)進(jìn)行HE染色，高倍顯微鏡下觀察外膜剝離效果及內(nèi)膜的病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料（60 s組織出血量）用（x±s）表示，1 g/L濃度的膠原酶實(shí)驗(yàn)側(cè)與陰性對(duì)照側(cè)、2 g/L濃度的膠原酶實(shí)驗(yàn)側(cè)與陰性對(duì)照側(cè)間60 s組織出血量的比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血管外膜成功剝離

正常兔頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)分為內(nèi)膜、中膜及外膜，見圖1A。2 g/L膠原酶消化+眼科鑷剝離可達(dá)到外膜基本剝離的效果。HE染色下可見血管外膜結(jié)締組織基本剝離，平滑肌層暴露于最外層，見圖1B。而1 g/L組血管外膜剝離不徹底HE染色下可見仍殘留部分結(jié)締組織，見圖1 C；4 g/L組血管外膜剝離完全，血管破裂，無(wú)法取材。

2.2 眼科鑷刮剝血管外膜至血管廣泛出血

正常兔頸動(dòng)脈外膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)主要包括外彈力層、滋養(yǎng)血管、神經(jīng)末梢及周圍疏松結(jié)締組織，如圖2所示。經(jīng)膠原酶消化后，血管外膜結(jié)締組織明顯疏松，易用眼科鑷銳性剝離外膜結(jié)締組織，在刮剝的過(guò)程中，因外膜結(jié)締組織消失，使外膜滋養(yǎng)血管廣泛暴露損傷，最終血管出血，見圖3。

2.3不同濃度膠原酶對(duì)血管外膜消化程度影響

1g/L的膠原酶消化動(dòng)脈外膜不徹底，無(wú)法造成動(dòng)脈穩(wěn)定出血，1 g/L實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s出血量與陰性對(duì)照側(cè)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮為組織損傷后炎性滲出。2 g/L實(shí)驗(yàn)側(cè)膠原酶消化+鈍性剝離血管外膜造成的出血穩(wěn)定，血管外膜基本剝離，見圖1B，未予任何處理后，出血不能自止，該組實(shí)驗(yàn)側(cè)出血量明顯高于陰性對(duì)照側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。4 g/L組實(shí)驗(yàn)組60 s出血量大，出血量已超過(guò)紗條吸附液體量，無(wú)法進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡。見表1。

3 討論

外科手術(shù)中，術(shù)中出血不可避免，然而減少出血量，縮短手術(shù)時(shí)間，對(duì)手術(shù)預(yù)后有重要影響，而局部止血藥的應(yīng)用在其中起重要作用。目前局部止血藥物種類繁多，缺乏一種理想的局部出血模型來(lái)評(píng)價(jià)局部止血藥物的效果。

相關(guān)文獻(xiàn)[5-8]報(bào)道，動(dòng)脈壁是一個(gè)有序的層狀結(jié)構(gòu)，分為內(nèi)膜、中膜及外膜。外膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)主要包括外彈力層、滋養(yǎng)血管、神經(jīng)末梢及周圍疏松結(jié)締組織。血管結(jié)締組織內(nèi)包括膠原、彈性蛋白和多種組織細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）。血管外膜具有豐富的滋養(yǎng)血管，主要存在于大動(dòng)脈的外膜，起營(yíng)養(yǎng)血管外膜的作用。血管外膜的滋養(yǎng)血管分為外部滋養(yǎng)血管、內(nèi)部滋養(yǎng)血管以及靜脈滋養(yǎng)血管。血管外膜主要構(gòu)成了血管的支撐結(jié)構(gòu)和提供滋養(yǎng)血管的作用，全程參與了血管損傷與修復(fù)的全過(guò)程。

Kunio等[3]、Rall等[4]采用單純的外科手術(shù)銳性損傷血管導(dǎo)致血管出血。該手術(shù)方法難度較大，由于器械直接損傷血管全層，操作過(guò)程中易導(dǎo)致動(dòng)脈瘤形成、血管直接破裂，出現(xiàn)不可控制出血。國(guó)內(nèi)牟華明等[5]也曾嘗試采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜對(duì)血管牽張作用強(qiáng)，易刮傷血管壁造成機(jī)械損傷、出血。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)器械直接銳性刮剝血管易導(dǎo)致血管破裂、出血迅速、出血量大、無(wú)法定量測(cè)定、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡。

湯月霞等[9]、胡遠(yuǎn)程等[10]采用膠原酶消化血管外膜方法，發(fā)現(xiàn)膠原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜變?yōu)榘咨琀E染色下發(fā)現(xiàn)外膜較消化前明顯疏松，容易用器械鈍性剝離。剝離至外膜白色疏松組織消失的程度，HE染色下發(fā)現(xiàn)外膜基本剝離干凈。

本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化+眼科鑷剝離血管外膜方法，使血管結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致血管出血。考慮到實(shí)驗(yàn)的操作性、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的量化，我們選取了供血豐富、分支較少、位置相對(duì)表淺易暴露的兔頸動(dòng)脈，在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兔頸動(dòng)脈較腹主動(dòng)脈、股動(dòng)脈等大動(dòng)脈便于操作，暴露充分，對(duì)周圍組織影響小，出血量可達(dá)滿意效果。

1g/L濃度組實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s滲出量與陰性對(duì)照側(cè)相差不大，通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，血管外膜仍殘留部分結(jié)締組織，外膜滋養(yǎng)血管未裸露，提示1g/L濃度膠原酶消化血管外膜不徹底，經(jīng)眼科鑷鈍性剝離后，血管無(wú)明顯出血。2 g/L膠原酶組實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s滲出量與陰性對(duì)照側(cè)有顯著差異，HE染色發(fā)現(xiàn)，血管外膜結(jié)締組織剝離徹底，外膜滋養(yǎng)血管廣泛裸露，內(nèi)膜及中膜無(wú)破壞，提示2 g/L膠原酶消化外膜徹底，經(jīng)眼科鑷鈍性剝離后，外膜滋養(yǎng)血管廣泛出血，出血量穩(wěn)定，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 g/L濃度組60 s出血量已超過(guò)紗條吸附液體量，且血管破裂，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡，提示4 g/L膠原酶消化外膜過(guò)度。

綜上所述，2 g/L膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜可導(dǎo)致外膜滋養(yǎng)血管廣泛破壞，而血管中膜及內(nèi)膜結(jié)構(gòu)未破壞，出血量及出血速度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)操作可重復(fù)性及操作性好，因此可以成為一種評(píng)估局部止血藥物效果的穩(wěn)定、理想的出血模型。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.

Kunio等[3]、Rall等[4]采用單純的外科手術(shù)銳性損傷血管導(dǎo)致血管出血。該手術(shù)方法難度較大，由于器械直接損傷血管全層，操作過(guò)程中易導(dǎo)致動(dòng)脈瘤形成、血管直接破裂，出現(xiàn)不可控制出血。國(guó)內(nèi)牟華明等[5]也曾嘗試采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜對(duì)血管牽張作用強(qiáng)，易刮傷血管壁造成機(jī)械損傷、出血。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)器械直接銳性刮剝血管易導(dǎo)致血管破裂、出血迅速、出血量大、無(wú)法定量測(cè)定、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡。

湯月霞等[9]、胡遠(yuǎn)程等[10]采用膠原酶消化血管外膜方法，發(fā)現(xiàn)膠原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜變?yōu)榘咨琀E染色下發(fā)現(xiàn)外膜較消化前明顯疏松，容易用器械鈍性剝離。剝離至外膜白色疏松組織消失的程度，HE染色下發(fā)現(xiàn)外膜基本剝離干凈。

本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化+眼科鑷剝離血管外膜方法，使血管結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致血管出血。考慮到實(shí)驗(yàn)的操作性、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的量化，我們選取了供血豐富、分支較少、位置相對(duì)表淺易暴露的兔頸動(dòng)脈，在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兔頸動(dòng)脈較腹主動(dòng)脈、股動(dòng)脈等大動(dòng)脈便于操作，暴露充分，對(duì)周圍組織影響小，出血量可達(dá)滿意效果。

1g/L濃度組實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s滲出量與陰性對(duì)照側(cè)相差不大，通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，血管外膜仍殘留部分結(jié)締組織，外膜滋養(yǎng)血管未裸露，提示1g/L濃度膠原酶消化血管外膜不徹底，經(jīng)眼科鑷鈍性剝離后，血管無(wú)明顯出血。2 g/L膠原酶組實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s滲出量與陰性對(duì)照側(cè)有顯著差異，HE染色發(fā)現(xiàn)，血管外膜結(jié)締組織剝離徹底，外膜滋養(yǎng)血管廣泛裸露，內(nèi)膜及中膜無(wú)破壞，提示2 g/L膠原酶消化外膜徹底，經(jīng)眼科鑷鈍性剝離后，外膜滋養(yǎng)血管廣泛出血，出血量穩(wěn)定，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 g/L濃度組60 s出血量已超過(guò)紗條吸附液體量，且血管破裂，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡，提示4 g/L膠原酶消化外膜過(guò)度。

綜上所述，2 g/L膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜可導(dǎo)致外膜滋養(yǎng)血管廣泛破壞，而血管中膜及內(nèi)膜結(jié)構(gòu)未破壞，出血量及出血速度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)操作可重復(fù)性及操作性好，因此可以成為一種評(píng)估局部止血藥物效果的穩(wěn)定、理想的出血模型。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.

Kunio等[3]、Rall等[4]采用單純的外科手術(shù)銳性損傷血管導(dǎo)致血管出血。該手術(shù)方法難度較大，由于器械直接損傷血管全層，操作過(guò)程中易導(dǎo)致動(dòng)脈瘤形成、血管直接破裂，出現(xiàn)不可控制出血。國(guó)內(nèi)牟華明等[5]也曾嘗試采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜對(duì)血管牽張作用強(qiáng)，易刮傷血管壁造成機(jī)械損傷、出血。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)器械直接銳性刮剝血管易導(dǎo)致血管破裂、出血迅速、出血量大、無(wú)法定量測(cè)定、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡。

湯月霞等[9]、胡遠(yuǎn)程等[10]采用膠原酶消化血管外膜方法，發(fā)現(xiàn)膠原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜變?yōu)榘咨琀E染色下發(fā)現(xiàn)外膜較消化前明顯疏松，容易用器械鈍性剝離。剝離至外膜白色疏松組織消失的程度，HE染色下發(fā)現(xiàn)外膜基本剝離干凈。

本實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化+眼科鑷剝離血管外膜方法，使血管結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致血管出血。考慮到實(shí)驗(yàn)的操作性、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的量化，我們選取了供血豐富、分支較少、位置相對(duì)表淺易暴露的兔頸動(dòng)脈，在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兔頸動(dòng)脈較腹主動(dòng)脈、股動(dòng)脈等大動(dòng)脈便于操作，暴露充分，對(duì)周圍組織影響小，出血量可達(dá)滿意效果。

1g/L濃度組實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s滲出量與陰性對(duì)照側(cè)相差不大，通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，血管外膜仍殘留部分結(jié)締組織，外膜滋養(yǎng)血管未裸露，提示1g/L濃度膠原酶消化血管外膜不徹底，經(jīng)眼科鑷鈍性剝離后，血管無(wú)明顯出血。2 g/L膠原酶組實(shí)驗(yàn)側(cè)60 s滲出量與陰性對(duì)照側(cè)有顯著差異，HE染色發(fā)現(xiàn)，血管外膜結(jié)締組織剝離徹底，外膜滋養(yǎng)血管廣泛裸露，內(nèi)膜及中膜無(wú)破壞，提示2 g/L膠原酶消化外膜徹底，經(jīng)眼科鑷鈍性剝離后，外膜滋養(yǎng)血管廣泛出血，出血量穩(wěn)定，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 g/L濃度組60 s出血量已超過(guò)紗條吸附液體量，且血管破裂，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物迅速死亡，提示4 g/L膠原酶消化外膜過(guò)度。

綜上所述，2 g/L膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜可導(dǎo)致外膜滋養(yǎng)血管廣泛破壞，而血管中膜及內(nèi)膜結(jié)構(gòu)未破壞，出血量及出血速度穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)操作可重復(fù)性及操作性好，因此可以成為一種評(píng)估局部止血藥物效果的穩(wěn)定、理想的出血模型。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.