多肽檢測方法研究進展*

欒崇林，蔣曉華，金 剛，代建國

（深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518088）

多肽檢測方法研究進展*

欒崇林，蔣曉華，金 剛，代建國

（深圳職業技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518088）

本文對質譜法（MS）、液相色譜質譜聯用法（LC-MS）、毛細管電泳質譜聯用（CE-MS）法、光譜分析法等在多肽檢測中的最新進展進行了綜述．質譜檢測多肽最大的優勢在于穩定性、重現性好，準確性高．采用色譜或電泳分離技術與質譜聯用可解決相同氨基酸組成但序列不同的多肽的檢測．光譜技術檢測多肽，通常無需樣品預處理分離，且光譜技術設計的多肽傳感方式靈活多變，但光譜技術往往需要借助其他方法才可對多肽進行定性分析，因此該方法不具有普遍性．

多肽；質譜；色譜；熒光；檢測

多肽通常是指由10~100個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物．也有文獻將2~10個氨基酸組成的肽稱為寡肽，10~50個氨基酸的組成的肽稱為多肽，50個以上氨基酸組成的肽稱為蛋白質[1]．多肽種類繁多，幾乎參與生物體的生長、發育、免疫、新陳代謝等各個環節，如促進礦物質吸收的肽（CPPS）、酶調節劑（如促胰酶肽）、激素肽（如生長激素釋放因子GRFS）等[2]．多肽作為生物標志物還涉及到某些疾病的病理研究，如 β淀粉樣肽在腦中的沉積與阿爾茲海馬病密切相關[3-6]，血清多肽對于一些惡性腫瘤的診斷也很有幫助[7]．除此以外，某些動物在受到外界刺激時，會產生大量的具有抗菌活性的多肽，這些多肽不僅具有很強的殺菌能力，有的還可殺死腫瘤細胞[8]，這類特殊的多肽被稱為抗菌肽，目前并已被應用于食品、飼料添加劑及藥物的開發等．本文根據檢測技術的分類，對檢測多肽的新方法研究進展進行綜述，并對多肽檢測領域的發展前景進行展望．

1 質譜法及其聯用方法

用質譜所檢測出的多肽質量譜圖，通常被稱為指紋圖譜．質譜檢測的多肽最大的優勢在于穩定性、重現性好，準確性高．目前將質譜技術應用于多肽檢測主要有基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）方法、液相色譜—質譜聯用(LC-MS）方法以及毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）方法．

MALDI-TOF-MS法所用儀器主要由2部分組成：基質輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質量分析器（TOF）．MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離．TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比．MALDI-TOF-MS法具有靈敏度高、準確度高、分辨率高及自動化程度高、分析速度快等特點，而且能滿足多肽組學和蛋白組學高通量檢測分析的要求．然而MALDI-TOF-MS法對多肽檢測時，它僅對含精氨酸的多肽有較高的精確度．2000年，Hale課題組提出將賴氨酸上的ε氨基修飾O-甲基異脲，使其變成高精氨酸，這樣使得賴氨酸也很容易被檢測到，此方法大大提高了檢測胰蛋白酶分解的多肽片段的靈敏度，并對于含有很高的（賴氨酸/精氨酸）含量比值的多肽的檢測非常有效[9]．2010年，Wu課題組首次報道了將半胱氨酸修飾的 Mn2+摻雜 ZnS納米顆粒（即Mn2+-doped ZnS@cysteine NPs）作為基質，用MALDI-TOF-MS檢測多肽的方法[10]．與其他的基質相比，如ZnS NPs、Zn@Cyseine NPs以及α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA），在水相中合成的該Mn2+-doped ZnS@cysteine NPs納米基質在檢測小分子多肽方面以及在檢測靈敏度方面更具優越性，并且此方法成功應用到了尿樣中多肽混合物的檢測．隨后，2011年Lie課題組研究出了簡單、靈敏、高通量的用MALDI-TOF-MS檢測多肽的新方法，他們通過將量子點加入基質中使其得以改善，檢測多肽及混合物時，靈敏度大大提高[11]．

以上2種方法均是通過改善基質來提高多肽檢測的靈敏度．也有研究者通過改善樣品前處理過程，以達到提高檢測靈敏度的目的．2012年，Nadnudda等人設計了一種非常靈敏的用MALDI-MS法檢測血清中多肽的新方案，他們利用正電或者負電兩性均聚物形成反向膠束，對預先除去HSA和IgG的血清中的低豐度多肽如血管緩激肽、C4a、ITIH4等以及生物標志物前列腺抗原（PSA）分別進行選擇性的預富集處理，再利用MALDI-MS對經過預富集處理后的樣品進行檢測，靈敏度大大增強，檢測血管緩激肽、C4a、ITIH4檢出限分別為0.5、0.08、0.2 ng/mL，PSA的檢出限為0.5 ng/mL[12]．2013年，Lai課題組著重于改善MALDI-TOF質譜法的免疫共沉淀的預處理步驟，設計了一種非常靈敏的檢測淀粉肽β1-28的新方法，并實現了其在人血漿中靈敏度低至6.14 pm的檢測[13]．他們通過提高抗體與小分子多肽的親和力，對其在復雜的人血漿基質中進行預富集．合成含有6E10和4GB兩種淀粉肽β1-28單克隆抗體組合而成的F(ab’)-(PEG)24小球，通過兩種抗體對目標多肽的共同的親和作用力將其分離，使得檢測靈敏度大大增強．

除以上的一些方法以外，也有研究者對某些含有特殊氨基酸的多肽進行了檢測．有數據表明97%的蛋白和17%的多肽片段都含有半胱氨酸，因此若能提高半胱氨酸的檢測靈敏度便能提高質譜低豐度蛋白、多肽檢測靈敏度．2012年Shimada等人設計了 6種半胱氨酸的標記物，大大提高了MALDI-TOF-MS檢測含有半胱氨酸的多肽的檢測靈敏度，從而也提高了親水性多肽、低豐度多肽的檢測靈敏度[14]．

然而，質譜在檢測具有相同氨基酸組成但序列不同的多肽時，由于它們具有相同的分子量，給出等同的分子離子峰，因此不能滿足多肽結構的解析工作．采用色譜或電泳分離技術與質譜聯用是解決這一問題的很好途徑．2003年，Thomas等人將液相色譜法與質譜聯用，實現了血管緊張肽Ⅱ、鈴蟾肽、緩激肽、黑化誘導神經肽、神經降壓肽和P物質等多種多肽的檢測，檢出限低至1 ng/mL，線性范圍1-100 ng/mL，并隨后用質譜實現了含氯水中的多肽氧化產物的定性檢測[15]．2005年，Karine等人發展了一種將高場非對稱波形離子遷移譜（FAIMS）與納米液相色譜-質譜（nanoLC-MS）結合的方法，即nanoLC-FAIMS-MS，該法可從復雜的胰蛋白酶水解物中靈敏而選擇性地檢測多電荷的肽離子．FAIMS技術作為一種氣相離子分離技術，可以減少化學噪音，增強多肽的檢測信號，與傳統的nanoLC-MS技術比，信噪比提升了6~12倍，可檢測出的多肽的數量提升了 20%[16]．2006年，Mario等人利用LC-MS技術實現了人類尿液中興奮劑胰島素類似物的靈敏檢測，他們將固相微萃取技術與免疫親和純化技術結合，從而實現了人類尿液中目標物的濃縮富集和分離，隨后利用在線質譜進行定性，然后再通過LC-MS技術對賴脯胰島素（Humalog LisPro）、門冬胰島素（Novolog Aspart）以及賴谷胰島素（Apidra Glulisine）進行了定量分析，檢出限低至0.05 ng/mL (9 fmol/mL)[17]．2009年，Andreas等人也利用LC-MS實現了人類尿液中二十四肽促皮質素的檢測，他們用表面覆蓋抗體的磁性小球對目標物進行磁分離（免疫親和純化技術）預富集處理，隨后用LC-MS進行定性定量分析，最后實現了尿樣中目標物二十四肽促皮質素的檢測，檢出限低至3 pg/mL[18]．2009年，劉麗紅等建立了一種氨基酸組成相同序列不同的多肽的LC-ESI-MS分析新方法．在反向色譜模式下，2種小分子三肽Gly-Phe-Ser和Gly-Ser-Phe實現了較好的分離，實驗證實，流動相組成及pH值對分離行為及檢測靈敏度具有重要影響，在以20mmol/L乙酸銨-水-乙腈（50:45:5，V/V/V）作為流動相在pH7的條件下洗脫，該方法重現性好、準確度高、靈敏度高．此方法的建立對其他此類氨基酸組成相同序列不同的蛋白質及多肽的分離分析具有參考意義[19]．

與HPLC相比，毛細管電泳（CE）的分離效率更高、上樣量更少，是一種靈敏的多肽檢測方法．周國華等以血管緊張素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、P-物質和生長激素抑制劑混合物為測定對象，用CE-ESI-MS法分離鑒定了5種生物活性肽．pH為5.0和4.5的NH4Ac緩沖液能在LPA涂層柱和胺涂層柱上很好地分離上述5種肽類混合物．在選擇的離子檢測模式下，檢出限（3δ）分別約為193、240、804、153和185 fmol，測定相對誤差（%）分別為0.015、-0.067、0.064、-0.031和0.074[20]．Varesio E.等建立了一種測定人血漿中 amyloid-β肽（Mr=4330.0，40個氨基酸）的CE-MS方法．并利用柱切換技術克服了毛細管柱底靈敏度，不易進行體內低濃度樣品測定的缺點．采用HP1100 MSD單級四級桿質譜，選用ESI離子源，正離子檢測，采用SIM模式．最低檢測限為50ng/mL[21]．

2 多肽熒光光譜分析法

熒光光譜多肽分析法通常通過體系中多肽的含量所引起的體系熒光強弱的變化而實現多肽的檢測．2009年，Hamachi課題組設計了一種新型的針對雙磷酸化多肽的熒光探針 1-2Zn()Ⅱ，實現了 10-6mol/L雙磷酸化多肽的檢測．現有的2-2Zn( )Ⅱ探針對于不同位點磷酸化(i, i + n)的多肽都能檢測，但選擇性較差，而 1-2Zn()Ⅱ探針專門針對雙磷酸化位點為（i, i+1）的多肽，因此與現有的雙磷酸化多肽探針 2-2Zn()Ⅱ相比，性能更優越，選擇性更好[22]．2010年，Lim等人合成了一種選擇性檢測半胱氨酸或者含 N-端半胱氨酸殘基多肽的熒光探針，該探針為不飽和醛基功能化的發色團，該物質與含巰基的半胱氨酸或者半胱氨酸殘基反應后的生成物，可產生強烈的熒光，即產生與目標物相關的“turn-on”模式的信號響應[23]．近些年，隨著熒光共振能量轉移（FRET）火熱發展，FRET技術已經廣泛應用到了各類生物和化學物質的分析檢測之中[24-27]，多肽的檢測也不例外．2012年，Takahashi等人設計出了一種可檢測淀粉體多肽Aβ1-42的蛋白，并將其命名為CPYAB4，由熒光供體藍綠色熒光蛋白 CFP、熒光受體黃色熒光蛋白YFP以及連接序列GGS三部分構成．體系中不含目標物情況下，CPYAB4發生分子內的FRET效應，CFP熒光有效猝滅，熒光強度極弱；當體系中含有目標物淀粉體多肽Aβ1-42時，CPYAB4與其發生反應，結構發生變化，CFP與YFP之間距離發生變化，于是阻礙了CPYAB4分子內的FRET效應，CFP的熒光不能被有效猝滅，體系熒光大大增強，其增強程度與Aβ1-42的濃度密切相關[28]．

除了上述利用熒光方法檢測多肽以外，其他的一些光譜技術也逐漸深入到多肽檢測的領域中來．例如，在2005年Xie等人用拉曼光譜來表征氨基酸，通常磷酸化的氨基酸和多肽由于–OPO32-與–OPO3H-的存在隨著體系pH的變化而變化，而拉曼光譜中，980 cm-1和 1080 cm-1處的磷酸絲氨酸帶（–OPO3H-）和磷酸蘇氨酸帶（–OPO32-）容易受臨近基團的影響，從而為磷酸化的氨基酸和多肽的表征帶來了困難，于是 Xie等人利用 drop coating deposition Roman（DCDR）方法很好地解決了以上問題，順利地對不同pH體系中的磷酸質子化的多肽和氨基酸進行了表征[29]．另外，在 2010年，Mustafa等人利用橢圓偏振光譜測量的內部全反射模式（TIRE）檢測β-淀粉樣肽Aβ（1-16），在該法中，利用Aβ（1-16）以及其單克隆抗體DE2直接免疫反應而形成的復合物靜電吸附于金表面，從而實現了β-淀粉樣肽（1-16）在0.05 ng/ml ~ 5 ug/ml范圍內的免標記檢測[30]．隨后在2011年，Wang等人設計了一種共振光散射檢測β-淀粉肽1-42的方法．基于納米金聚集后產生更強的光散射信號，目標分子的出現會引起納米金的聚集狀態．當體系中沒有Aβ1-42時，預先存在的Zn2+首先會引起生物素修飾的Aβ1-16聚集，親和素修飾的納米金也因表面的親和素與生物素間較強的作用而產生聚集，因而產生很強的共振光散射信號；體系中含有Aβ1-42時，Zn2+與 Aβ1-42 作用力更強而優先與之發生反應，使得之前的納米金聚集反應無法順利進行，共振光散射信號明顯減弱，其信號減弱程度與目標物Aβ1-42的濃度密切相關[31]．

總之，利用光譜技術檢測多肽，通常無需復雜的樣品前處理分離技術，且光譜技術設計的多肽傳感器靈活多變，適用于各種不同體系下的多肽檢測．

3 其他多肽檢測法

Hou等發展了一種簡單、快速，超靈敏的檢測生物素修飾的多肽的方法[32]．該方法首先將生物素修飾的多肽固載于硝化纖維膜上，通過抗體與生物素之間的反應，抗體修飾的納米金發生反應后形成紅點，紅點的強度通過Quantity One（一種定量分析軟件）記錄．檢出限低至100 amol，檢出范圍是1pmoL~1μmol．隨后用銀進行信號放大，靈敏度低至100 zmol，檢出范圍100 zmoL~100 fmol．再如，Brambilla等人將毛細管電泳與激光誘導熒光結合（CE-LIF），有效地檢測并監控了β-淀粉樣多肽與聚合納米顆粒的相互作用，為CE-LIF法的開發提供了一定的實驗和理論基礎，開辟了新的研究前景[33]．Kawulka 等采用同位素標記技術，以13C、15N 標記化合物的核磁共振（NMR）新技術測定了一種分離自一種細菌Bacillus subtilis 中新的抗微生物多肽Subtilosin A的結構，最新出現的HPLC-MS-NMR聯用集合了HPLC-MS 與HPLC-NMR 這兩種聯用技術的優點，使得在線獲得更多的多肽產物樣品的結構信息成為可能[34]．Louden 等以D2O 為流動相在線聯用HPLC-UV-IR，-HNMR-MS技術分離分析了Sileneotites，Silenenutans，Silenef rivaldiskyana的提取物中的20 種蛻皮激素和蛻皮類固醇[35]．楊茜璐等建立了一種非探針標記型磷酸化多肽的電化學檢測方法，該方法以N，N-二（羧甲基）–L-賴氨酸（Lys-NTA）和Fe3+修飾的金電極作為磷酸化多肽的捕獲和傳感界面，利用磷酸化多肽能夠與之形成金屬離子螯合物而發生特異性結合并引起電極表面修飾層通透性改變等特點，采用鐵氰化鉀作為電化學指示劑，用循環伏安法和交流阻抗法對磷酸化多肽的結合進行表征和檢測．磷酸化多肽濃度在5~75 μmo l/L時，循環伏安圖中峰電流隨著磷酸化多肽濃度的增大而增大，而非磷酸化多肽不能引起峰電流變化[36]．

4 展 望

研究者已經開發出多種依賴不同的檢測技術的多肽檢測方法，并已經成功實現了多肽超高靈敏性，高選擇性的檢測，并為生物醫藥、臨床病理論等方面的研究提供了強有力的支持．然而，很多多肽片段因其分子量小，結構普通，對它們的在復雜基質中（如尿液，血漿等）超痕量的檢測仍然存在著巨大的挑戰，多肽檢測方法的開發仍然還有很大的探索空間．尤其是電化學方法作為新興的多肽檢測方法，具有所用儀器簡單、靈敏、快速等特點，是一個很有發展潛力的分析技術．

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Peptide Detection: A Brief Review

LUAN Chonglin, JIANG Xiaohua, JIN Gang, DAI Jianguo

（School of Applied Chemistry and Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055,China）

In this paper, a review was made on study of mass spectrometry, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), spectroscopic method and other approaches in detection of polypeptide. Mass spectrometry approach is characterized by good stability，reproducibility and accuracy. LC-MS or CE-MS can detect polypeptide with the same amino acid composition but different sequence of amino acid. Spectrometry can detect Polypeptide with great flexibility to transduce the detecting signals without sample pretreatment and separation, but it cannot conduct a qualitative analysis of polypeptide, which limits its wide application.

peptide; mass-spectrum; chromatograph; fluorescence; detection

O656.31

A

1672-0318（2014）05-0054-06

10.13899/j.cnki.szptxb.2014·05, 011

2014-01-15

*項目來源：深圳市基礎研究計劃資助項目（No. 20120531204110）

欒崇林（1965-），山東人，博士，教授，主要研究方向：電化學傳感技術．