細菌線性質粒的復制研究

朱云霞 趙昕 張綺思 張海方

（江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，鎮江 212013）

質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，廣泛存在于許多生物中，習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA 分子，它們能為宿主提供一些額外的功能，如抗藥性和毒力等，絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA 分子。1979 年，在產抗生素的土壤微生物——婁徹鏈霉菌中發現了第一例原核生物線性質粒［1］，到目前為止，已在數十種鏈霉菌中發現了線性質粒，其分子大小在12-640 kb 之間［2］。1985 年，在疏螺旋體中發現了另一大類線性質粒［3］。近來有研究表明，細球菌屬也有大線性質粒存在，這些紅球菌的大線性質粒缺陷株對紅霉素的抗性明顯減弱［4］。線性質粒的發現糾正了所有細菌質粒都是環狀結構這一傳統觀點。線性質粒作為一種特殊的質粒分子，成為近年來基礎微生物學研究的一個新熱點。關于線性質粒的結構、復制、遺傳和生物學功能等方面雖然已有了一定的研究，特別是近幾年在其復制的分子機制研究方面有了長足的進步，但距離科學開發和利用線性質粒還很遠。

1 質粒復制的一般概述

質粒的復制和染色體的復制一樣也可以分為起始、延伸和終止3 個階段。其中復制的起始最為重要，主要包括復制起始點（oriV）的識別和復制起始復合物的裝配［5］。復制起始位點一般都有一富A-T 區和多個重復序列（重復子）和DnaA 結合位點，質粒編碼的復制起始蛋白Rep 和宿主細胞的復制起始蛋白如DnaA 等能以有序的方式與oriV 的重復子結合，從而促使雙螺旋熔解形成開鏈復合體啟動復制［5］。每個細胞中的質粒數即質粒的拷貝數在細胞里從單一到數千都有可能，質粒的拷貝數是受到多種機制嚴格控制的，是質粒本身的一種復制特性體現［5］。環狀質粒的復制以θ 復制方式和滾環復制方式為主。θ 復制被認為是革蘭陰性菌中質粒復制的主要方式，而滾環復制被認為是革蘭陽性菌中質粒復制的主要方式。

2 線性質粒的復制

原核生物線性質粒的復制及其環狀類似物的復制過程基本相同，而線性質粒則必需解決如何復制DNA 的3'最末端這個問題。因此，線性質粒的末端對其復制和穩定存在是必需的。原核生物線性質粒根據其末端結構的不同主要有兩大類，一類其末端為共價閉合的發夾狀結構；另一類其末端共價結合了蛋白質（末端蛋白）［6］。帶有發夾末端的線性質粒雖然是雙鏈線性分子，但其中一條鏈的5'和3'端分別與另一條鏈的3'和5'端直接連在一起；帶有末端蛋白的線性質粒含有末端反向重復序列和末端蛋白。鑒于線性質粒的這些特殊的結構特征，線性質粒的復制在保留環狀質粒復制過程中的基本規則外增添了許多自己的復制特點，如復制起始點的序列特征差異和線性質粒的獨特的5'末端復制機制等［7］。

2.1 線性質粒的復制起始區

復制的起始是整個質粒復制的關鍵所在，因此線性質粒復制起始區的鑒定是研究某一線性質粒的復制機制的第一步。大量關于線性質粒復制起始區的鑒定等研究工作主要集中在鏈霉菌的線性質粒上。研究表明，大部分鏈霉菌線性質粒的復制起始區一般都只有一個，位于線性質粒的中部區域，其與環裝質粒一樣也有一富A-T 區和一些重復序列，但與環狀質粒的復制起始區的序列特征會有所不同［8］。然而，2010 年，Zhang 等［9］在鏈霉菌屬線性質粒pFRL1 中發現了兩個復制起始區，一個位于質粒中心部位；另一個靠近質粒的一個末端，這兩個復制起始區在復制起始過程中可能存在某種協作作用。因此，線性質粒的復制起始區可以只有一個，也可以有兩個或兩個以上，當有兩個或兩個以上的起始區時，它們可以在不同情況下執行各自的功能，這種機制還有待進一步研究。

不同物種遺傳物質的復制起始區通常都具有相似性和保守性，如在復制起始區和終止區GC 含量會發生明顯轉折，因此對于線性質粒復制起始區的鑒定，可以利用序列比對分析和GC 含量偏移分析（GC skew）等生物信息學手段進行預測，然后設計試驗加以驗證［10，11］。

2.2 線性質粒的復制模型

2.2.1 具有共價閉合發夾末端的線性質粒復制模型 具有共價閉合發夾末端的線性質粒并不多見，主要見于疏螺旋體中的線性質粒。此外，只發現N15 原噬菌體質粒及奧克西托克克雷白桿菌的一個約50 kb 的線性質粒pKO2，以及小腸結腸炎耶爾森菌噬菌體質粒PY54［12-15］。這種以閉合發夾為末端的線性復制子的可能的復制方式有以下4 種［16-19］：（1）復制從內部起始區開始并沿著兩個方向延伸至發夾末端，產生一個環狀的二聚體，此二聚體帶有連在一起的端粒序列，形成了反向重復區域，此反向重復區經端粒解離酶作用使得環狀二聚體被切開，隨后兩條雙鏈的末端又形成了共價閉合末端，復制得以完成；（2）復制起始于閉合的發夾末端，隨著復制叉的移動形成了與第一種復制方式中相同的環狀二聚體，后面的復制過程與第一種相同；（3）共價閉合的線性分子經特異性酶切后產生于兩端產生對稱的切口，使兩條閉合的鏈被分開，形成線性不相連的雙鏈結構，隨后此雙鏈結構被環化，利用DNA 聚合酶補齊缺口形成一個完整的環狀分子，此環狀分子由內部起始雙向復制形成子代環狀分子，再經特異性酶切回復線性結構，相應末端相連，形成兩個共價閉合的線性分子，完成復制；（4）與第三種方式相似，共價閉合的線性分子首先經特異性酶切產生缺口形成黏末端的雙鏈分子，接著短缺的3'末端由DNA 聚合酶按模板鏈補齊，隨后每條鏈的末端發生重構形成折回結構，為子鏈復制提供了3'-OH，在DNA 聚合酶的作用下復制叉不斷前移，最后形成兩個共價閉合的線性分子。

2.2.2 具有末端蛋白結構的線性質粒復制模型 具有蛋白帽子末端結構的線性質粒主要來自放線菌，其典型的代表是鏈霉菌的線性質粒。研究表明，婁徹氏鏈霉菌中的線性質粒的復制是從內部起始區開始向兩端進行的雙向復制［20，21］。當新合成鏈5'末端的RNA 引物被切除后，就在5'末端產生了一個缺口，這一缺口的可能通過以下3 種不同的末端補丁機制來進行填補［22-26］。（1）折回模型。3'前導鏈的突出部分借助多拷貝回文序列與內部互補序列堿基配對形成莖環結構，末端蛋白經輔助蛋白招募至此3'末端并識別末端的復雜結構，隨后DNA 聚合酶使用末端蛋白作為引物啟動復制從而填補缺口；（2）重組模型。首先，在完整的父代雙鏈分子末端以末端蛋白為引物合成了與前導鏈的5'端序列相同的DNA 序列，新合成的DNA 序列取代父代雙鏈中前導鏈的5'端，被取代的帶有末端蛋白的父代前導鏈5'端序列隨后與子代懸突的3'端序列堿基互補配對，形成了一個半霍利迪交叉結構，從而通過同源重組完成了鏈置換，最后消除產生的半霍利迪交叉結構；（3）末端發夾模型。前導鏈3'末端的13 bp長的回文序列折回形成一個小的發夾結構，此發夾結構末端作為引物在DNA 聚合酶的作用下啟動復制并填補缺口，隨后末端蛋白結合于發夾結構的開始處并在此切斷使前導鏈的3'端發生短缺，最后在DNA 聚合酶的作用下以新合成的完整后隨鏈為模板從5'到3'方向填補好前導鏈3'端的短缺。

3 線性質粒pBSSB1 及其復制機制的研究現狀

近年來，在傷寒沙門菌中也發現了線性質粒pBSSB1，該線性質粒是目前為止在腸桿菌科中發現的唯一線性質粒，其介導了H：z66 陽性傷寒沙門菌鞭毛的單向相變換［27，28］。pBSSB1 全長27 kb，共編碼33 個基因，其中包括二相鞭毛素編碼基因fljBz66和fljA 樣基因。本實驗室完成了fljBz66的表達調節機制研究和fljA 樣基因對一相鞭毛素編碼基因fliC 的抑制功能鑒定［29-31］。pBSSB1 兩端為1.2 kb 左右的末端反向重復序列（Terminal inverted repeats，Tirs），Tirs 是鏈霉菌線性質粒所具有的結構特征，推測pBSSB1 與鏈霉菌屬的線性質粒相似，可能也是具有蛋白帽子末端結構的線性質粒。通過對其序列比對分析和GC 含量偏移分析（GC skew），提示在它的第17 號編碼基因的上游存在一個雙向復制的起始位點［27］。此外，本實驗室的研究表明，細菌基因組編碼的Fis 蛋白可以影響該質粒的穩定性，推測其可能通過調控線性質粒復制必需的末端蛋白編碼基因影響pBSSB1 的復制［32］。但目前為止，關于線性質粒pBSSB1 的復制機制還不甚清楚，如與質粒復制關系非常密切的該質粒拷貝數是否在細菌不同的生長時期有所變化，質粒上非常重要的復制起始點還未通過具體的實驗加以驗證確定，該線性質粒所編碼的一系列基因與復制的關系等，這些問題都亟待研究解決，從而才能全面揭示該線性質粒復制的分子機制。

4 結語

雖然線性質粒的復制與環狀質粒的復制有很多共性，但線性質粒復制有自己的特點。它最大的特點就是需要面對與真核生物染色體復制相同的問題：如何填補5'末端的缺口。具有蛋白帽子末端結構的線性質粒利用末端蛋白作為引物在DNA 聚合酶的作用下啟動復制填補缺口；具有共價閉合發夾末端的線性質粒利用其閉合的末端避開了會產生缺口這一問題，在復制結束時利用端粒解離酶或其他特異性酶切開相連的末端再重新連接，恢復共價閉合的發夾末端。本文所提及的解決這一末端填補問題的每一個復制模型都有其合理性，是否還有其他復制模型存在還有待于進一步深入的研究加以揭示。

在具有蛋白帽子末端結構的線性質粒復制模型中，末端蛋白發揮了重要作用。雖然很多線性質粒本身具有末端蛋白的編碼基因（tpg），但也有一些小的質粒本身沒有tpg，需要借用宿主染色體編碼的末端蛋白來完成復制。已有研究發現，一些線性質粒本身編碼或宿主染色體編碼的末端輔助蛋白可以招募宿主染色體編碼的末端蛋白，從而完成自身的復制［33］，這其中的機理還有待研究。同時，線性質粒在復制過程中是否會通過整合到宿主染色體上，利用宿主的資源完成自身復制后再獨立出來，即線性質粒的復制與宿主染色體復制之間的聯系還有待研究。

另外，研究表明有一些鏈霉菌屬的線性質粒末端序列缺失后，其兩端可融合并以環狀形式復制［9］，因此這些末端序列是維持質粒以線性形式復制的必要元件；既然線性質粒在一定情況下可以環狀形式復制，這種線性復制與環狀復制的轉換是否也會發生在自然條件下還有待研究。

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