HCV抗體ELISA檢測假陽性分析

張力　張文娟

[摘要] 目的 探討HCV抗體ELISA檢測1

[關鍵詞] 丙型肝炎病毒；抗體；酶聯免疫法

[中圖分類號] R156.3 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）03-114-04

現臨床丙型肝炎病毒（HCV）感染初步診斷一般依賴于抗體檢測結果，檢測方法一般為酶聯免疫吸附法[1]，ELISA法經過多年的發展，靈敏度高、特異性強，在臨床中得到了普遍的應用。但是該法存在假陽性情況，且丙肝治療主要用干擾素、利巴韋林等藥物[2]，如若誤診會加重患者負擔，導致醫療糾紛。本文探討當檢測結果1

1 材料與方法

1.1 一般資料

2012年1月～2013年9月時間段內在患者知情同意情況下篩選濱州醫學院附屬醫院內HCV抗體ELISA首次檢測1

1.2 方法與試劑

1.2.1 標本采集 清晨空腹采集血液標本3mL，真空負壓式抽血針注入BD公司兔腦粉分離膠-促凝管，采集完畢后37℃水浴箱溫育30min，放入離心機內3000rpm/min離心5min，確認血清與紅細胞分層清晰，無溶血，無纖維蛋白殘留。

1.2.2 儀器和試劑 亞特斯ADALTIS Nexgen Four全自動酶免疫分析儀；HCV Ab定性試劑為北京科衛（第三代）ELISA試劑盒。

1.2.3 步驟 所有檢測由經過培訓的工作人員嚴格遵循廠家操作程序說明和SOP，同時每次操作均同時進行室內質控測定，確保每次實驗處于在控狀態，同時參加衛生部臨檢中心室間質量評價確保結果合格。嚴格按照《2010版中國藥典》酶聯免疫法步驟進行操作，操作前將保存于2～8℃冰箱內的試劑取出放至室溫環境下30min，微孔板設空白對照1孔+陽性對照2孔+陰性對照3孔+標準物質1孔，每孔為樣品稀釋液100μL，陽性對照、陰性對照、標準物質或待測標本10μL。用去離子水按1∶20使用50mL濃縮洗液配置洗滌液。實驗在NEXGEN FOUR內根據預設程序進行，加入樣本后反應時間60min，洗板加酶后反應時間30min，加入顯色劑A、B液后反應時間30min。

實驗結束后NEXGEN FOUR使用空白孔校零雙波長450nm/620nm下讀取各孔OD值，然后將將結果傳輸至康金軟件進行判讀。

1.2.4 判斷標準 所有標本使用科衛試劑分3次進行檢驗，取3次S/CO均值。1≤S/CO判斷為有反應性（R），1>S/CO判斷為陰性（N）。

1.3 統計學方法

統計分析采用SPSS19.0軟件，數據以（）表示，計量資料采用t檢驗，計數資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.001為差異有高度統計學意義。

2 結果

對HCV抗體ELISA首次檢測1

對比人群正常體檢人群首次檢測HCV抗體陰性20例，2～6個月內再次檢測仍全為陰性。將首次檢測和2～6個月再次檢測結果分為兩組，選擇四格表x2檢驗，總例數n≥40且所有格子的t≥5，x2=27.219，P<0.01兩組數據有顯著性差異。

3 討論

丙肝起病隱匿[4]，由于HCV包膜糖蛋白的高變異性以及體外細胞培養模型缺乏導致丙肝有效疫苗的研制進展緩慢[5]，現尚無應用于人體的可預防丙肝病毒感染的有效疫苗[6]。但是丙肝早期可以治愈[7]，同時丙肝后期時間長用藥昂貴[8]，所以要求丙型肝炎病毒（HCV）抗體檢測結果應該盡量準確以便為臨床治療提供有效依據。但是通過上面46例人群ELISA檢測結果可以看到，首次檢測有反應性26例2～6個月之間再次檢測有6例抗體檢測結果轉變為陰性，20例陰性人群仍為陰性，使用SPSS19.0統計軟件分析后得出首次檢測和2～6個月再次檢測結果兩組數據P<0.01，有統計學差異，所以HCV抗體檢測有反應性并不能確診丙肝，應同時加做RIBA實驗[9-10]或進行HCV RNA檢測[11]。根據最終確診結果可以看出6例抗體首次檢測有反應性再次檢測為陰性者未感染HCV，所以如果首次檢測抗體酶標法顯示有反應性的話，應進行隨訪檢測，隨訪結果可有效的避免首次檢測導致的誤導，有助于對感染狀態做出準確的判斷。

現跟隨基因技術的進步和制作工藝的提高，丙肝初篩ELISA法經過不斷的改良，經歷了第一代、第二代試劑，已經發展到第三代，包被微孔板上第三代試劑抗原采用核心區C22-3抗原和及非結構基因NS3（C22）、NS4（C33c、C100-3）抗原，核心區抗原比例相對下降，NS3區C33c比例增高，加入NS5抗原，敏感性、特異性與較第一、二代試劑相比提高較大[12-13]，但是并不能排除假陽性，文獻[14-16]顯示HCV ELISA檢測與HCV RNA等其他方法相比較存在假陽性。

分析酶聯免疫吸附法假陽性原因主要有以下幾點：（1）試劑因素。抗-HCV ELISA試劑盒雖經多年發展，現多采用基因工程重組丙型肝炎病毒抗原包被固相，但是仍存在抗原不純、多克隆抗體和酶結合物純度低等容易導致假陽性結果的影響因素[17]。（2）患者體內內源性物質干擾，如類風濕因子、高免疫球蛋白、超氧化物歧化酶等干擾因素與固相HCV抗原結合導致顯色假陽性。（3）操作影響。全自動酶免分析儀可有效避免加樣不準確、孵育溫度波動、時間過短、人為失誤等因素，但是標本溶血、細菌污染、凝固不全等因素無法避免，同時洗板針堵塞、抽吸不全或注液量不足等導致洗板不徹底的因素，都可引起假陽性。

本研究中工作人員嚴格按照操作規程操作，有效避免了人為錯誤，分析6例ELISA首次檢測假陽性的原因主要有：批次試劑之間的差異性，部分批次試劑靈敏度過高或特異性較低；患者體內內源性物質干擾。

HCV-Ab酶聯免疫吸附試驗（ELISA）雖然操作簡單、靈敏度高、特異性強，但是存在較高的假陽性情況，容易對臨床造成誤導。通過首次檢測和2～6個月再次檢測我們也可得出，雖然HCV抗體ELISA試劑存在假陽性的情況，但是若是在2～6個月內再次進行復查則可有效的排除假陽性情況。報告顯示[18]全球如非洲等部分地區醫療負擔較重，人均醫療水平較低，中國社科院發布報告[19]指出我國中西部和農村醫療資源與東部相比差距較大，對于這些可能無法具有RIBA實驗、HCV RNA檢測或發光檢測的醫療條件的邊遠或經濟不發達地區2～6個月間復查可疑HCV抗體結果比較實用。當然對于HCV抗體ELISA檢測有反應性者應盡早進行HCV-RNA等測定[20]，以便幫助臨床早期確切診斷丙肝。

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（收稿日期：2013-11-03）