鎘通過氧化應激機制誘導LLC—PK1細胞損傷

方鑫　李海玲　安彩艷

[摘要] 目的 探討鎘誘導豬腎近曲小管上皮細胞（LLC-PK1）毒性及氧化應激在其中的作用。 方法 用不同濃度的氯化鎘刺激細胞9h和25μmol/L的氯化鎘刺激細胞不同時間，采用Formazan 分析細胞存活率反映鎘對細胞的損傷程度；以還原型谷胱甘肽（GSH）為靶點，影響GSH濃度的兩個試劑BSO和NAC，觀察鎘誘導細胞損傷中氧化應激的作用。 結果 隨著氯化鎘染毒時間延長，細胞存活率下降，同樣，隨著劑量的增加，細胞的存活率逐漸也下降。同時BSO加重鎘誘導的細胞損傷，NAC完全抑制鎘誘導的細胞損傷。 結論 氯化鎘對LLC- PK1細胞具有明顯的毒性，細胞損傷是通過氧化應激介導，且與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系。

[關鍵詞] 氯化鎘；豬腎近曲小管上皮細胞；氧化應激

[中圖分類號] R114 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）03-34-03

鎘是主要重金屬環境污染物，由于其分布廣泛和較長的生物半衰期（16～33年），導致容易在體內肝，腎等重要器官蓄積，從而造成重要器官的損傷，如神經退行性病變，肝，肺，腎的功能障礙和血管系統疾病[1-2]。而長期低劑量接觸鎘主要引起以近曲小管損傷為主要特征的腎臟損害[3]。鎘引起腎細胞損傷是具體通過什么機制，尚未完全清楚。本研究選用豬腎近曲小管上皮細胞（LLC-PK1）為實驗對象，觀察了氯化鎘對該細胞的毒性效應，以及誘導LLC-PK1細胞損傷中氧化應激所起的作用，為進一步闡明鎘誘導腎細胞損傷機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

小牛血清、消化酶、抗體、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、氯化鎘、D-L-丁硫氨酸-[R]-亞砜亞胺（BSO）等化學試劑均購買于Sigma公司（Tokyo，Japan）。全自酶聯免疫檢測儀（Bio-tek，USA），CO2培養箱（Heraeus instruments，Germany）。Olympus IX71型倒置顯微鏡（Olympus，Hachioji-shi，Tokyo，Japan）。

1.2 細胞培養

豬的腎小管上皮細胞系LLC-PK1購自American Type Culture Collection（Rockville，MD）。培養液選用胎牛血清（DMEM/F12）培養基加5%小牛血清和雙抗（青霉素和鏈霉素各100U/mL），于恒溫細胞培養箱（37℃，5% CO2）中培養，待細胞貼壁生長約90%傳代，每周傳代2～3次。

1.3 Formazan分析

細胞活性用CCK-8（Dojindo Laboratory，Kumamoto，Japan）試劑來檢測。CCK-8試劑中含有WST–8：化學名稱：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazan）。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。

劑量時間-效應關系：細胞以1.5×105的密度鋪于96孔板中，用DMEM/F12培養基加5%小牛血清，放置于37℃、5% CO2中培養箱中48h后，將培養基換成1%的小牛血清，再用氯化鎘刺激。每孔加CdCl2應用液10mmol/L使CdCl2終濃度分別為0、5、15、25、50、75μmol/L，培養9h，并以25μmol/L的終濃度對細胞分別染毒0、1、3、6、9、12h，然后每孔加入10μL CCK-8反應1h，再用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，進行統計分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，實驗數據用（）表示。多組均數比較用單因素方差分析，組間多重比較用Dunnett-t檢驗，以P<0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 氯化鎘對LLC-PK1細胞的毒性作用

采用Formazan分析法測定細胞的相對活性。觀察指標是細胞的存活率。由表1可見：用CdCl2（25μmol/L）刺激細胞1h與對照組比較，細胞存活率沒有差異，3，6，9，12h各組與對照組比較，細胞存活率逐漸下降，差異有統計學意義（P<0.01）。由表2可見，用不同濃度的鎘細胞染毒9h后，5μmol/L的氯化鎘對細胞有輕度的增殖作用，其細胞存活率是103.15%，其他劑量組與對照組相比，細胞存活率均明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）。隨著CdCl2濃度的增加，其毒性作用逐漸增大，有劑量-反應關系。

2.2 鎘通過氧化應激介導細胞損傷

研究表明大部分鎘誘導細胞損傷是由氧化應激介導的[4-5]，因此，本實驗檢測鎘誘導LLC-PK1細胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應激調節。用細胞內主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點。結果如表3所示：細胞分成兩組，一組對照，一組實驗組加50μmol/L CdCl2培養9h后，用BSO（2.5mmol/L）抑制細胞內谷胱甘肽（GSH）濃度，處理后實驗組的細胞存活率為17.53%，明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。相反，用NAC（2.0mmol/L）來增加細胞內GSH濃度，處理后可見實驗組和對照組的細胞存活率沒有差異見表3。

3 討論

鎘是主要的工業和環境污染物之一，腎臟是其作用的主要靶器官。本實驗通過Formazan分析法測定細胞存活率表明鎘對LLC-PK1細胞的毒性效應有良好的劑量-時間效應關系，時間-效應關系可見氯化鎘作用細胞9h，已呈現明顯的毒性效應，細胞的存活率已下降（63.53%），見表1，隨著CdCl2濃度或時間的增加，LLC-PK1細胞的存活率呈明顯下降趨勢。但5μmol/L CdCl2刺激細胞時，細胞有增殖的現象，這與紀存委等[6]的報道鎘對細胞存在Hormesis效應，即在較低濃度時具有刺激細胞生長的作用，而高濃度時則對細胞有抑制作用，的結果一致。結果表明CdCl2對LLC-PK1細胞毒性有良好的劑量-時間效應關系。此結果與任香梅等[7]結果一致。endprint

Gennari等報道，鎘可以促進氧自由基的形成[3]和降低細胞內主要抗氧化物質-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會造成多種細胞損傷。大多數毒性作用是由氧化應激所介導[9-10]。藍暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨及聯合染毒L02細胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應激有關[11]。環境污染物，包括工業和日用化工，農藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導致氧化應激的主要因素。本實驗檢測鎘誘導LLC-PK1細胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應激調節。用細胞內主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護作用[12]。本實驗結果顯示，同樣，NAC增加細胞內GSH濃度能明顯減輕鎘導致的細胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細胞內GSH濃度可以加重鎘導致的細胞損傷（表3），此結果與陽光等[13]研究相同。這說明鎘誘導的細胞損傷是通過氧化應激介導，同時與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系，但其具體分子機制需要進一步研究。

綜上所述，氯化鎘對LLC-PK1細胞有明顯毒性，具有很好的時間-劑量-效應關系。鎘誘導的細胞損傷是通過氧化應激介導，同時與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系。本研究結果為今后研究提供理論依據，但鎘如何影響細胞內的谷胱甘肽的水平的具體機制需進一步研究。

[參考文獻]

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[11] 藍暉翔，江松，紀存委，等.鎘與汞聯合作用對人胚肝細胞凋亡和DNA 損傷的影響[J].環境與健康雜志，2013，30（2）：98-101.

[12] 王雨，裴秀叢，史新竹，等.氯化鋅和N-乙酰半胱氨酸對鎘誘導人肝癌細胞株SMMC-7721凋亡的影響研究[J].中國冶金工業醫學雜志，2012，29（5）：513-515.

[13] 陽光，仲來福.鎘所致腎毒性及氧化性損傷機制[J].毒理學雜志，2005，9（3）：233.

（收稿日期：2013-11-06）endprint

Gennari等報道，鎘可以促進氧自由基的形成[3]和降低細胞內主要抗氧化物質-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會造成多種細胞損傷。大多數毒性作用是由氧化應激所介導[9-10]。藍暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨及聯合染毒L02細胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應激有關[11]。環境污染物，包括工業和日用化工，農藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導致氧化應激的主要因素。本實驗檢測鎘誘導LLC-PK1細胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應激調節。用細胞內主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護作用[12]。本實驗結果顯示，同樣，NAC增加細胞內GSH濃度能明顯減輕鎘導致的細胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細胞內GSH濃度可以加重鎘導致的細胞損傷（表3），此結果與陽光等[13]研究相同。這說明鎘誘導的細胞損傷是通過氧化應激介導，同時與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系，但其具體分子機制需要進一步研究。

綜上所述，氯化鎘對LLC-PK1細胞有明顯毒性，具有很好的時間-劑量-效應關系。鎘誘導的細胞損傷是通過氧化應激介導，同時與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系。本研究結果為今后研究提供理論依據，但鎘如何影響細胞內的谷胱甘肽的水平的具體機制需進一步研究。

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Gennari等報道，鎘可以促進氧自由基的形成[3]和降低細胞內主要抗氧化物質-谷胱甘肽（GSH）的濃度[8]，會造成多種細胞損傷。大多數毒性作用是由氧化應激所介導[9-10]。藍暉翔等研究表明，氯化鎘、氯化汞單獨及聯合染毒L02細胞可引起顯著的DNA損傷。這可能與氧化應激有關[11]。環境污染物，包括工業和日用化工，農藥，化肥，重金屬和電離輻射，重金屬，特別是鎘是導致氧化應激的主要因素。本實驗檢測鎘誘導LLC-PK1細胞的損傷，觀察其是否同樣受氧化應激調節。用細胞內主要抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）作為研究的靶點。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是抗氧化劑、巰基保護劑，也是一種自由基清除劑，研究也顯示，對急性、亞慢性鎘染毒大鼠肝、腎損傷具有明顯的拮抗和保護作用[12]。本實驗結果顯示，同樣，NAC增加細胞內GSH濃度能明顯減輕鎘導致的細胞損傷，效果非常明顯，BSO降低細胞內GSH濃度可以加重鎘導致的細胞損傷（表3），此結果與陽光等[13]研究相同。這說明鎘誘導的細胞損傷是通過氧化應激介導，同時與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系，但其具體分子機制需要進一步研究。

綜上所述，氯化鎘對LLC-PK1細胞有明顯毒性，具有很好的時間-劑量-效應關系。鎘誘導的細胞損傷是通過氧化應激介導，同時與細胞內的谷胱甘肽的水平有著密切關系。本研究結果為今后研究提供理論依據，但鎘如何影響細胞內的谷胱甘肽的水平的具體機制需進一步研究。

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