布氏菌苗皮內與劃痕接種的效果評價

陳 成，魏 東，李恪梅，付麗麗，黃長江，王國治

布魯氏菌簡稱布氏菌(Brucella)，是革蘭氏陰性，兼性胞內寄生菌，具有侵襲力強、傳染途徑多、引起多器官損傷的特點。布魯氏菌病(簡稱布病)是一種由布魯氏菌屬引起的一類人獸共患疾病，嚴重威脅著人類和多種動物的生命安全[1]。據調查，全世界200多個國家和地區已經有170多個存在布病疫情[2-4]，在我國布病波及28個省市區，并且近年疫情反彈，死灰復燃，每年造成近千萬元的損失。

目前，雖然治療布病主要使用抗生素，但是長期應用抗生素容易造成細菌耐藥[5]。因此，預防接種布氏疫苗仍是我國目前預防布氏菌感染和傳播最實際、最有效的方法[6]。疫苗接種的方法有滴鼻、注射、氣霧及皮膚劃痕等[7-8]。我國從1965年開始采用皮上劃痕接種牛種弱毒株104M菌株[9]。該方法接種復雜，不能定量接種，常伴有局部或異常反應，被接種者皮膚有損傷和劃痕時疼痛，遺留疤痕不易被接受。與皮上劃痕比較，皮內注射接種方式具有定量接種、節省菌苗、操作簡單，同時又能改善被接受者痛苦的優點。改善疫苗的免疫途徑是疫苗研究的熱點，國內外有學者對布氏疫苗免疫方法進行深入的研究和探索[10]。

本次研究對豚鼠進行皮內注射和皮上劃痕兩種方式免疫布氏菌活疫苗，通過體液免疫、細胞免疫和免疫保護力試驗結果來比較兩種免疫方式的免疫效果，為皮內注射布氏菌活疫苗取代傳統人用皮上劃痕布氏菌活疫苗提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級Hartly豚鼠，雌性，300～350 g，共15只，由中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)實驗動物中心提供( 實驗動物生產許可證號: SCXK( 京) 2009-0017) ，飼養于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物室。

1.1.2菌種 皮內和劃痕用布氏活疫苗為皮上劃痕人用布氏菌活疫苗、羊布氏菌M5弱毒株均由中檢院結核病疫苗室提供。

1.1.3變應原 Br-PPD蛋白，由中檢院結核病疫苗室提供，制備方法見參考文獻[11]。

1.1.4試劑 布氏菌培養基(腦心瓊脂購自美國BD公司)、牛血清白蛋白(BSA)美國Sigma公司購進、堿性磷酸酶標記山羊抗豚鼠IgG(美國Bethyl公司)、pNPP底物顯色液(SurModics)

1.1.5實驗儀器 生物安全柜(telstar bio-Ⅱ-A)、酶標儀(Labsystems Dragon-MK3)、恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器-DH6000AB型)、高速離心機(德國eppendorf-5415D)

1.1.6實驗耗材 15 mL離心管，50 mL離心管、96孔培養板。

1.2方法

1.2.1分組及免疫 將15只300～350 g體重SPF級豚鼠隨機分成3組，每組5只。第1組為皮內注射組(5×107/只)；第2組為皮上劃痕組(9.5×109/只)；第3組為陰性對照組(生理鹽水)。皮內接種即先將豚鼠右大腿外側脫毛，然后用酒精擦拭后，待酒精揮干，后肢皮內注射，劑量為100 μL/只；劃痕接種即先將豚鼠右大腿外側脫毛，然后用酒精擦拭后，待酒精揮干，用1 mL無菌注射器針頭在免疫部位劃#字，確保表皮開裂后，在#字上均勻涂布菌液50 μL/只，等待5 min后，用無菌醫用干棉球吸干表面菌液完成免疫。

免疫4周后，對每只豚鼠進行心臟抽血，分離血清，-20 ℃保存，用于豚鼠ELISA抗體檢測。

1.2.2抗體水平檢測 用間接 ELISA法檢測小鼠血清IgG的效價。以滅活布氏菌體5×108/mL的濃度包被96孔酶標板，4 ℃過夜；以PBST 300 μL 洗板5次，用1%的BSA封閉(200 μL/孔)，37 ℃靜置1 h；每孔加入100 μL的50×開始倍比稀釋的待檢血清，37 ℃靜置1 h；按1∶2 500稀釋的堿性磷酸酶標記山羊抗豚鼠IgG，洗板后100 μL/孔加入，37 ℃靜置1 h；洗板，加入100 μL/孔的PNPP底物顯色液，室溫避光28 min后加入100 μL/孔終止液(3 mol/L的NaOH)終止反應；在波長為405 nm處檢測吸光值A405。

1.2.3遲發型變態反應(DTH) 采血3 d后，暴露豚鼠背部皮膚，除毛，皮內注射PPD變態反應原，注射劑量均為每只30 μg，每點0.2 mL。注射24 h和48 h后分別觀察注射部位出現紅腫反應，并測量平均硬結反應直徑，以縱、橫直徑相加除以2≥5 mm為陽性標準，計算陽性反應率。

1.2.4布魯氏菌活苗免疫保護力檢測 豚鼠皮膚實驗3 d后，對每只豚鼠皮下攻擊羊種布氏菌M5弱毒株，攻擊劑量為5×108CFU/只，攻擊部位為后肢皮下。3周后斷頸處死豚鼠，無菌取脾臟，通過脾臟細菌計數比較布魯氏菌活苗兩種免疫方式的保護效果。

2 結 果

2.1血清中總IgG水平測定 兩種方式免疫豚鼠均能產生高滴度抗體，與陰性對照組比較差異有統計學意義(F=593.628，P<0.05，n=15)。但皮內組與劃痕組相比差異無統計學意義(t=0.365，P>0.05，n=10)。說明兩種方式免疫產生的體液免疫效果無明顯差異，結果見圖1。

2.2遲發型變態反應試驗結果(DTH) 皮內組和劃痕組豚鼠針對PPD抗原24 h及48 h的DTH陽轉率均為100%，結果見表1。

3 討 論

兩種方式免疫豚鼠抗體檢測結果表明，體液免疫中的皮內注射組和皮上劃痕組均能產生高滴度的IgG抗體，劃痕組產生的抗體效價幾何均數為11 143，皮內注射組抗體效價幾何均數為9 700。從效價水平來看，劃痕組略高于皮內組，經統計學分析，兩者間差異無統計學意義。實驗結果顯示皮內注射免疫和皮上劃痕免疫均能誘導較強的體液免疫應答，兩者體液免疫效果相近。

圖1 血清IgG抗體效價

表1 Br-PPD免疫4周后皮膚試驗結果

布氏菌是一種胞內寄生菌，寄生于單核巨噬細胞內，能夠逃脫宿主細胞免疫系統的監視，所以細胞免疫是機體對抗布病主要的免疫方式[12]。皮膚變態反應又稱遲發型變態反應，發揮其效應細胞有CD4+Th1細胞，CD8+或CD4+CTL，以及一部分巨噬細胞及中性粒細胞等[13]。皮膚遲發型超敏反應是進行體內細胞免疫評價的有效方法，本次試驗結果顯示皮內組和劃痕組兩種接種方式Br-PPD變應原DTH陽轉率均為100%，表明兩種方式免疫均能誘導機體產生較強的細胞免疫應答。

為評價兩種免疫方式的保護效果，用羊布氏菌M5弱毒株攻擊，陰性組豚鼠脾臟分離出大量的羊M5布氏活菌，皮內組和劃痕組豚鼠脾臟均無羊M5布氏菌存在，表明兩種方式免疫布氏菌活苗均可使豚鼠獲得很強的免疫保護。

綜上所述，通過體液免疫檢測、細胞免疫評價和疫苗免疫保護力實驗3個方面結果顯示，兩種方式免疫豚鼠獲得免疫效果幾乎相當，說明皮內注射接種有希望代替皮上劃痕接種方法，至于能否真正取代傳統接種方法，還有待強毒布魯氏菌攻擊保護試驗和臨床試驗進一步研究。

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