生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離及耐藥性分析

王 娟,黃秀梅，曲志娜，趙思俊，蓋文燕，王玉東，王君瑋

金黃色葡萄球菌在自然界中分布非常廣泛，空氣、水及人和動物的排泄物中都能分離到，因此食品受其污染的機會很多，是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。為了解我國目前生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染狀況以及分離菌株的耐藥情況，本文對山東、山西、湖南、重慶以及內蒙的部分奶牛場和擠奶站采樣進行監測，為指導奶牛養殖場安全合理用藥和保障消費者食品安全提供保障。

1 材料與方法

1.1質控菌株 金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213、表皮葡萄球菌ATCC12228，購自中國獸醫藥品監察所。

1.2主要試劑和培養基 7.5%NaCl肉湯、Baird-Parker瓊脂、MH肉湯、生化反應管，均為北京陸橋技術有限公司生產；科瑪嘉顯色培養基鄭州科瑪嘉生物有限公司生產；凍干兔血漿廣東環凱生物技術有限公司生產；Master Mix美國Promega公司生產；藥敏板天津市金章科技發展有限公司生產；瓊脂糖西班牙Biowest生產；Marker 2000 寶生物工程(大連)有限公司生產。

1.3主要儀器設備 恒溫培養箱、可見分光光度計、基因擴增儀(BIO-RAD)、凝膠成像系統(BIO-RAD)等。

1.4樣品采集 2013年春季分別從山東、山西、重慶、內蒙、湖南等5省(區、市)選擇3個擠奶站或奶牛場采集樣品，采集擠奶時前3把后的牛奶作為樣品，每個點采集40份樣品，共采集鮮奶樣品600份。冷藏條件下，48 h內運送至實驗室。

1.5金黃色葡萄球菌的分離與鑒定

1.5.1細菌分離 取1 mL牛奶樣品接種到10 mL7.5%NaCl肉湯中，于37 ℃溫箱震蕩培養20 h后，將增菌后的液體接種于Baird-Parker平板，36 ℃培養48 h，然后挑取可疑菌落接種到科瑪嘉顯色培養基上，劃線接種到營養瓊脂純化培養后，待進一步細菌鑒定。

1.5.2形態鑒定 在Baird-Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為渾濁帶，最外層有一透明圈,在科瑪嘉顯色培養基上為粉色到紅色圓形菌落。

1.5.3生化鑒定 挑取純化好的單個菌落進行觸酶試驗和血漿凝固酶試驗。觸酶試驗陽性的菌落再進行血漿凝固酶實驗；血漿凝固酶實驗中，呈現凝集者判為陽性，則該菌為金黃色葡萄球菌陽性。

1.5.4PCR鑒定 用DNASTAR 軟件自行設計1 對引物，上游引物nuc上：5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′，下游引物nuc下：5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′。擴增片段長度約為279 bp。煮沸法提取DNA，反應體系(25 μL)如下：上下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，Mix 12.5 μL ，加ddH2O補至25 μL。PCR循環條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，擴增36個循環；最后72 ℃延伸10 min。取PCR擴增產物5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含EB 0.5% μg/mL)，電泳結束后，在紫外燈下觀察并用電泳圖像分析系統拍照，記錄試驗結果。

陽性菌株擴增產物送上海生物工程有限公司測序。

1.6耐藥基因檢測 參照參考文獻[1]設計9 對引物，用PCR方法對分離鑒定金黃色葡萄球菌進行耐藥基因檢測。不同耐藥基因擴增引物見表1。

表1 耐藥基因擴增引物

1.7藥物耐藥性檢測 按照CLSI 2008推薦的肉湯稀釋法測定分離菌株對7類13種抗菌素的MIC值。7類13種抗菌藥分別是：青霉素類(青霉素、氨芐西林、奧格門丁)；林可霉素類(克林霉素)；頭孢類(頭孢西丁、頭孢噻呋)；大環內酯類(替米考星、紅霉素)；萬古霉素類(萬古霉素)；磺胺類(磺胺異惡唑、新諾明)；喹諾酮類(恩諾沙星、氧氟沙星)。

2 結 果

2.1細菌分離鑒定結果 從采集的600份生牛奶中,檢出金黃色葡萄球菌157株,檢出率為26.17%；其中山東省分離率為12.50%，湖南省分離率為31.67%，山西省為33.33%，重慶市為18.33%，內蒙為35.0%。

以標準菌株ATCC29213為陽性對照，從牛奶樣品中分離菌株能擴增出大小約為279 bp基因片段(圖1),陽性對照樣品均能擴增出預期大小的DNA基因片段。將分離菌株PCR產物測序結果表明，該基因片段長度為279 bp。序列結果與GenBank公布的序列同源性達99.5%以上，說明擴增的基因片段為金黃色葡萄球菌16S-23SrRNA基因的保守區序列。

圖1 金黃色葡萄球菌PCR擴增結果

2.2藥敏檢測結果 157株分離菌株除對恩諾沙星和萬古霉素均敏感外，對其余11種抗菌藥物均有不同程度的耐藥，尤其對青霉素類中青霉素和氨芐西林的耐藥率高達100%和98.73%；其次是對紅霉素和克林霉素的耐藥率分別為49.68%和43.95%；對奧格門丁、頭孢噻呋、頭孢西丁的耐藥率分別為31.21%、28.03%、18.47%；對磺胺異惡唑和復方新諾明的耐藥率分別為22.29%、5.73%；對氧氟沙星和替米考星的耐藥率分別為4.46%、3.18%。

各省分離菌株對11種抗菌藥物的耐藥性有所不同，5省區分離菌株中，山西省分離菌株的耐藥性最嚴重，如山西分離菌株對頭孢噻呋、頭孢西丁、奧格門丁、紅霉素磺胺異惡唑的耐藥率明顯高于其他省區的分離菌30%～70%；其余4省區分離菌株對這些藥物的耐藥性差別不很明顯，耐藥率在20%以上的藥物有4～5種。詳見圖2。

圖2 5省區牛奶中金黃色葡萄球菌耐藥性情況

分離菌株中，除1株耐1種藥物外，其余菌株均為多重耐藥，多重耐藥率為99.36%；無8耐及以上菌株，主要集中在2耐(36.05%)、3耐(19.77%)、5耐(12.79%)和6耐(17.44%)，占分離菌株數的86.05%。

2.3耐藥基因檢測結果 檢測結果表明，157株分離菌中，攜帶耐大環內酯類藥物的msrA基因菌株最多，占分離菌株數的97.45%，有38.22%的分離菌株攜帶另一耐大環內酯類藥物基因ermC；有70.06%的菌株攜帶耐β-內酰胺酶類藥物基因,14.01%的分離菌株攜帶耐MRSA重要基因femA；同時攜帶耐喹諾酮類藥物3種基因的分離菌株占94.99%；大多數分離菌株同時攜帶多種耐藥基因。具體見表2。

圖4 耐藥因子PCR擴增結果

2.4分析 從檢測結果看，生鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的污染較嚴重，檢出率為26.17%，與張彥春等的報道[2]一致。分離菌株耐藥性較以往報道[2]有上升趨勢，尤其是對青霉素類藥物的耐藥性非常嚴重，所有分離菌均耐青霉素，157株分離菌中，除2株菌外，其余菌株均對氨芐西林耐藥，其次是對紅霉素和克林霉素，耐藥率在40%以上，這與相關實驗室[3-6]的實驗結果基本吻合；且分離菌株的多重耐藥和交叉耐藥嚴重,多重耐藥率高達86.05%，與王登峰等人[5]的報道一致。另外，檢測出有29株MRSA，其中有22株攜帶femA基因；通過檢測發現，從耐藥表型看，分離菌株對該類藥的耐藥性不嚴重，但是大多數菌株攜帶耐喹諾酮類藥物基因，應引起重視。

表2 耐藥基因檢測結果

3 討 論

從采集的600份生牛奶中,檢出金黃色葡萄球菌157株,檢出率為26.17% ，結果說明這些奶牛養殖場和擠奶站的生牛奶存在金黃色葡萄球菌的污染,其主要源于在擠奶過程中污染了牛奶。奶牛場要定期檢查奶牛的乳房,并且奶擠出后,要迅速冷藏,細菌繁殖,以防毒素生成,奶制品要以消毒牛奶為原料,注意低溫保存。食品中食源性致病菌的污染是引發食品安全問題的重要原因之一,因此，從源頭上杜絕本菌對食品的污染,以降低金黃色葡萄球菌食物中毒的發生風險。

金黃色葡萄球菌對藥物的適應性較強，自20世紀60年代發現MRSA以來，該菌的檢出率呈上升趨勢，本研究共檢測到29株MRSA菌株，且所有MRSA菌株不僅對多種抗生素耐藥，而且還攜帶多種耐藥基因。耐甲氧西林和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌都是超級耐藥菌[7]。污染耐藥性金黃色葡萄球菌的動物性食品是導致人類感染的原因[8]。因此，為防止耐藥性金黃色葡萄球菌引起的危害，有必要對其進行耐藥性監測，保障人類健康。

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