豬2型鏈球菌安徽分離株的毒力基因、溶血性及耐藥性分析

焦安心，許大文，趙洪武，程 謙，鄭 浩，馬建華，魏建忠，孫 裴，李 郁

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是世界范圍內引致豬鏈球菌病最主要的病原，根據莢膜多糖可將S.suis分為35個血清型，即1型～34型和1/2型，其中2型(Streptococcussuisserotype 2,S.suis2)對豬的致病性最強，在世界范圍流行最廣，而且是重要的人獸共患病病原菌之一[1]。

S.suis2的致病性與其攜帶的毒力因子密切相關，目前公認的主要毒力因子有莢膜多糖(Capsular polysaccharide，CPS)、溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein，MRP)、胞外因子(Extracellular protein factor，EPF)和溶血素(Suilysin，SLY)等[2]。S.suis2毒力基因的分布具有地域性差異，不同地區S.suis2分離株可能含有不同的毒力因子，這是S.suis2不同分離株毒力不同的重要原因[3]。SLY在S.suis2侵入和裂解細胞的過程以及導致腦膜炎過程中發揮重要作用，溶血類型及溶血價常作為初步判斷其致病力強弱的重要指標之一[4]。目前，由于抗生素不合理應用，S.suis2耐藥現象日益嚴重，不同地區在抗生素的選擇壓力下，S.suis2的耐藥表型出現了地域性差異。

本研究通過對來自獸醫臨床上19株S.suis2安徽分離株的毒力基因、溶血性及耐藥性進行檢測分析，旨在為進一步研究S.suis2 安徽分離株的致病性奠定基礎，為有效防控豬鏈球菌病提供科學依據。

1 材料和方法

1.1受試菌株 19株S.suis2安徽分離株由安徽農業大學動物科技學院傳染病研究室分離、鑒定與保存，主要來自合肥、阜陽、亳州、安慶、宿州和蚌埠等地區。

1.2質控菌株 肺炎鏈球菌ATCC49619 購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3主要試劑 胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、水解酪蛋白瓊脂(M-H)購自紹興天恒生物科技有限公司；2×TaqPCRMasterMix，DNA Marker D2000、DNA Marker I均購自北京天根生化有限公司；25種藥敏紙片：氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、新霉素(NEO)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、丁胺卡那霉素(AN)、紅霉素(E)、阿奇霉素(AZZ)、吉他霉素(KIT)、四環素(TET)、強力霉素(DOX)、恩 諾 沙 星 (ENR)、環丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX)、克林霉素(CM)、潔霉素(LIN)、桿菌肽(BAC)、復方新諾明(SXT)、甲氧芐啶(TMP)、磺胺異惡唑 (SIZ)、氟苯尼考(FLO)、利福平(RA)均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4毒力基因檢測 參考文獻[5-6]分別針對cps2J、mrp、epf、sly合成引物(見表1)，特異性引物均由上海生物工程技術有限公司合成。

表1 用于擴增四種毒力因子的PCR引物

采用裂解法提取細菌DNA：挑取單菌落接種到含有5%血清的TSB中，培養24 h，取1 mL菌液加入1.5 mL離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入100 μL滅菌ddH2O混勻，置沸水中煮沸10 min，冰浴10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，即為DNA模板。

PCR擴增的反應體系：總體積25 μL ，其中2×TaqPCRMasterMix12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上下游引物各1 μL，模板5 μL。反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性45 s，cps2J、mrp、epf、sly退火溫度及時間分別為56 ℃ 50 s、55 ℃ 1 min、60 ℃ 55 s、58 ℃ 1 min，72 ℃ 延伸1 min，擴增30個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5溶血性檢測

1.5.1PA法檢測溶血類型 將19株S.suis2安徽分離株接種于含5%兔血的TSA平板，37 ℃培養24 h后觀察菌落周圍溶血狀態。單菌落周圍有透明溶血環的菌株判定為β溶血；單菌落周圍有草綠色溶血環的菌株判定為α溶血；不發生溶血的菌株為γ溶血。

1.5.2micro-ELISA法檢測溶血價 參考文獻[4,7]測定菌株溶血價，將各菌株接種于含5%血清的TSB，37 ℃靜止培養24 h制成種子液，取種子液按1%比例接種于含5%血清的TSB，37 ℃靜止培養，接種后8 h、12 h、16 h、20 h和24 h取培養液，12 000 r/min離心5 min，取上清，10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)生理鹽水倍比稀釋，將不同倍數稀釋的上清液和等量的1%兔紅細胞加入96孔板中，振蕩混勻，37 ℃作用2 h，4 ℃過夜沉淀，測OD540。溶解50%紅細胞的上清液的稀釋倍數即為溶血價，以5個時間點中測定的最高溶血價作為該菌株的溶血價。

1.6藥物敏感性檢測 以肺炎鏈球菌ATCC49619為質控菌株，采用美國臨床實驗室標準化委員會推薦的Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法及判定標準[8]。

2 結 果

2.1毒力基因檢測 19株S.suis2安徽分離株cps2J、mrp、epf和sly基因的檢出率分別為100%、68.4%、68.4%、89.5%，共分為7個基因型：cps2J+/mrp+/epf+/sly+、cps2J+/mrp+/epf-/sly+、cps2J+/mrp+/epf-/sly-、cps2J+/mrp-/epf+/sly+、cps2J+/mrp-/epf-/sly+、cps2J+/mrp-/epf-/sly-，其中cps2J+/mrp+/epf+/sly+所占比例達57.9%，為優勢基因型(見表2)。

表2 19株S. suis 2安徽分離株毒力基因檢測結果

2.2溶血性檢測 在19株S.suis2安徽分離株中，13株呈α溶血，溶血價為1∶4～1∶32；6株呈β溶血，溶血價為1∶32～1∶128。其中CH1溶血價為1∶64(β溶血)，SZ2溶血價為1∶32(α溶血)，未檢出sly基因。各菌株溶血類型、溶血價結果見表3。

表3 19株S. suis 2安徽分離株的溶血性

2.3藥物敏感性檢測 19株S.suis2安徽分離株對利福平、頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢唑啉的敏感率較高，分別達到89.5%、89.5%、78.9%、78.9%，對強力霉素、四環素、桿菌肽和磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為84.2%、84.2%、84.2%、78.9%；分離菌株普遍對氨基糖苷類抗生素耐藥或中介(見表4)。19株S.suis2安徽分離株均耐3種以上抗生素，且多重耐藥譜為強力霉素、四環素、桿菌肽和磺胺異惡唑，構成比為63.2%(見表5)。

3 討 論

目前雖然對S.suis2致病機制并不十分清楚，但普遍認為其致病性強弱與其毒力基因有關。cps2J、mrp、epf、sly是S.suis2重要的毒力基因，常作為檢測的靶基因，然而在不同的S.suis2分離株中，其分布特征存在著地區性差異。2009年，Verena Blume等[9]檢測101株源自腦膜炎、敗血癥、關節炎或肺炎豬體的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例為33.7%；同年，Wei等[10]針對我國16個省份，檢測176株源自腦膜炎、肺炎、關節炎或心內膜炎豬體的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例為54%。本研究中，來自臨診患病豬的19株S.suis2安徽分離株cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株所占比例為57.9%，表明安徽地區豬群中S.suis2的毒力基因型與國內相關報道基本一致，而與國外的報道存在一定差異。此外，不同健康狀況豬體上的S.suis2分離株中，cps2J、mrp、epf、sly的分布特征也存在差異。2000年，Florence等[2]同時對分離自患病豬和健康豬體的S.suis2進行檢測，54株源自患病豬體的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株占35.2%，9株源自健康豬的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株僅占30%；2013年，紀少博等[11]檢測194株源自我國不同地區健康豬上的S.suis2，cps2J+/mrp+/epf+/sly+的菌株為33.5%。從而顯示cps2J、mrp、epf、sly4種毒力基因與S.suis2的致病力強弱相關。

根據鏈球菌在血瓊脂平板上的溶血現象分為α、β和γ共3類，α-溶血性鏈球菌多為條件致病菌，β-溶血性鏈球菌致病力強，而γ-鏈球菌無致病性，故溶血性在鑒定鏈球菌的致病性方面有一定的意義。本研究中，19株S.suis2安徽分離株在兔血平板上呈現α和β兩種溶血類型，表明不同S.suis2安徽分離株對兔紅細胞溶血能力的差異性及其致病力的不同。鏈球菌溶血性的形成與其產生的SLY相關，SLY的產生量可以用溶血價來衡量。本研究中19株S.suis2，β溶血菌株的溶血價(1∶32～1∶128)高于α溶血菌株(1∶4～1∶32)，表明β溶血菌株能產生較多SLY，其毒力可能強于α溶血菌株，因為決定S.suis2毒力大小的因子是多方面的。SLY由sly基因編碼，sly基因全長1 494 bp，其5′端可發生變化，從而使sly基因喪失完整性，但這種不完整性卻沒有改變其溶血特性，甚至不影響其毒力大小[12]。本研究中，19株S.suis2安徽分離株均具有溶血活性，但其中1株β溶血和1株α溶血菌株未檢出sly基因，表明這兩株S.suis2安徽分離株的sly基因發生了改變。

抗生素療法是目前治療豬鏈球菌病的重要手段，由于臨床上濫用、亂用抗生素現象普遍，導致細菌耐藥性增強，給該病的防治帶來一定困難。本研究中，19 株S.suis2安徽分離株均為多重耐藥，其中對強力霉素、四環素、桿菌肽和磺胺異惡唑的耐藥率較高，分別為84.2%、84.2%、84.2%、78.9%，且對該4種抗生素的多重耐藥率達63.2%，對氨基糖苷類抗生素的耐藥率也較高(50%以上)，且中敏率高達42.1%，顯示出向產生耐藥性發展的趨勢，應得到足夠的重視。2005年，Vela等[13]報道，22株S.suis2法國分離株對四環素類、大環內酯類、磺胺類、林克酰胺類多重耐藥率達68.2%。2010年，徐引弟等[14]對35株S.suis2河南分離株藥敏試驗結果顯示，對復方新諾明、慶大霉素、四環素、鏈霉素、萬古霉素、氯霉素的耐藥情況嚴重。表明在抗生素選擇的壓力下，不同地區S.suis2分離株的耐藥特性及多重耐藥性譜存在一定的差異，因此，適時監測S.suis2的耐藥性及其變化趨勢，藥敏試驗篩選藥物，合理、科學、規范用藥，有利于減少和控制耐藥菌株的產生，對有效防控S.suis2病具有十分重要的意義。

表4 19株S. suis 2安徽分離株的藥物敏感程度分布

表5 19株S. suis 2安徽分離株多重耐藥譜的分布

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