Real-time PCR法用于日本血吸蟲感染宿主血清DNA的定量檢測及其感染度的評價(jià)

官 威，許 靜，孫 緩，梁 松，董蘭蘭，夏超明

診斷在血吸蟲病防治工作中對控制及消除傳染源發(fā)揮關(guān)鍵作用。核酸診斷技術(shù)以其特異性強(qiáng)、敏感度高、反應(yīng)快速，與病原體檢測具有同等確診價(jià)值，而成為血吸蟲病診斷技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。本課題組在前期工作中應(yīng)用PCR、nest-PCR和LAMP法均已在血吸蟲感染宿主血清中檢測出DNA并具有高度敏感性及特異性，顯示出潛在的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[1-5]。但是，之前已建立的核酸診斷技術(shù)局限于定性檢測。定量PCR與普通PCR相比，不僅具有高度的敏感性和特異性[6-7]，可定量檢測樣本[8-13]的DNA水平，對評價(jià)血吸蟲病感染度、感染宿主血清DNA水平變化具有重要意義。本研究應(yīng)用前期工作中發(fā)現(xiàn)的日本血吸蟲高度重復(fù)序列SjR2基因作為擴(kuò)增的靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立日本血吸蟲TaqMan real-time qPCR，擬通過定量檢測日本血吸蟲感染家兔血清DNA，確定早期檢測的時(shí)間節(jié)點(diǎn)及其檢測閾值，評價(jià)感染度，為血吸蟲病早期診斷及療效考核提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1實(shí)驗(yàn)動物模型的建立 清潔級新西蘭家兔10只，雌性，重量2.0～2.5 kg (蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，隨機(jī)分為5組，每組兩只。經(jīng)腹部皮下感染日本血吸蟲尾蚴，組1：30±2條；組2：50±2條; 組3：100±5條; 組4：200±10條; 組5：500±20條。陽性釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1．2標(biāo)本的收集 所有家兔在感染前取正常外周血清作為陰性對照。于感染后3 d、感染后1～7周(每周1次)采集各組家兔的外周血清；感染后第7周解剖家兔，收集成蟲計(jì)數(shù)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3DNA模板的制備

1．3．1成蟲DNA模板的制備 取日本血吸蟲雄蟲5條，用生理鹽水研磨后，加入等體積蟲體消化液(0.1 mol/L Tris-HC1、50 mmoL/L EDTA、1% 的SDS、500 μg/mL蛋白酶K，pH8.5)，65 ℃下作用1 h，并不時(shí)振蕩，再用酚氯仿抽提，取上清，用冷無水乙醇沉淀30 min，離心，常溫下用75% 的乙醇洗沉淀，棄上清，60 ℃烘箱內(nèi)干燥10 min，加50 μL TE緩沖液溶解沉淀。

1．3．2血清DNA模板的抽提[14]取感染兔血清200 μL，加入400 μL血清提取緩沖液(0.15 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HC1、2% 的SDS、5 μg/mL鮭魚精DNA、250 μg/mL蛋白酶K, pH7.6)，55 ℃下消化10 min, 等體積酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，12 000 g離心5 min，棄上清，再用氯仿異戊醇(24∶1)抽提，12 000 g離心5 min，棄上清，加入1/10體積NaAc(3 mol/L) 和2倍體積冷無水乙醇，-20 ℃下沉淀30 min，12000 g離心10 min，棄上清，常溫下75%乙醇洗沉淀兩次，第1次浸泡2 h，第2次浸泡30 min，并不時(shí)振蕩。12 000 g離心5 min，棄上清，60 ℃溫箱干燥10 min，加20 μL TE緩沖液溶解沉淀，4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1．4TaqMan real-time qPCR擴(kuò)增

1．4．1引物和TaqMan探針設(shè)計(jì) 引物和探針以陸正賢[15]等報(bào)道的日本血吸蟲高度重復(fù)基因SjR2為靶序列，綜合Vector NTI Advance?11.5分析結(jié)果設(shè)計(jì)：上游引物primer F: 5′-CAG GCT TCC TTA GCT ACG ACT CTA G-3′ ，下游引物primer R: 5′-GGA TCC TGT ATA CGC GTT TCA GA-3′ ，探針probe: 5′-FAM-ATC CCG CTC CAT CGA TAT CTG CTG C-3′ TAM。由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1．4．2Real-time PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體積25 μL，包括Platinum?2×PCR SuperMix-UDG (60U/mLTaqDNA聚合酶、40 mmol/L Tris-HCl, pH 8.4、KCl、6 mmol/L MgCl2、400 μmol/L dGTP、400 μmol/L dATP、400 μmol/L dCTP、800 μmol/L dUTP、40 U/mL尿嘧啶DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶、穩(wěn)定劑)、上下游引物和探針各10 μmol/L、50 mmol/L MgCl2、25 μmol/L ROX校對染料(甘氨酸結(jié)合的5-羧基-X-羅丹明琥珀酰酯、20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.4、0.1 mmol/L EDTA以及 0.01%的 Tween?20)，模板4 μL。反應(yīng)在ABI 7500定量PCR儀上進(jìn)行：50℃孵育5 min，95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃、15 s,60 ℃、1 min, 擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。在60℃循環(huán)溫度末端，每個(gè)循環(huán)的熒光量被測定。反應(yīng)數(shù)據(jù)通過7500 System SDS v1.4.0軟件分析。

1．5TaqMan定量PCR特異性和敏感度的評價(jià) 引物和探針的特異性通過正常家兔、健康人血清DNA、空白對照(三蒸水)以及其它成蟲模板來考核；反應(yīng)的敏感性以連續(xù)10倍稀釋的日本血吸蟲SjR2基因重組質(zhì)粒分析。

1．6重組質(zhì)粒的制備 將PCR產(chǎn)物(77 bp)連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109中，篩選陽性克隆菌落，提取質(zhì)粒CTE739，測序。由寶生物工程(大連)有限公司合成。

2 結(jié) 果

2．1EPG檢測及成蟲計(jì)數(shù)確定家兔感染度 如表1所示，組1平均每只家兔體內(nèi)檢出8條雌蟲、9條雄蟲，鏡檢EPG為14；組2平均每只家兔體內(nèi)檢出15條雌蟲、19條雄蟲, EPG為24；組3平均每只家兔體內(nèi)檢出25條雌蟲、43條雄蟲, EPG為48；組4平均每只家兔體內(nèi)檢出78條雌蟲、81條雄蟲, EPG為97；組5平均每只家兔體內(nèi)檢出186條雌蟲、194條雄蟲, EPG為232。

表1 EPG檢測與成蟲計(jì)數(shù)結(jié)果

2．2Real-time定量PCR的特異性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，曼氏血吸蟲、華支睪吸蟲、旋毛蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲、正常家兔血清樣本、健康人血清樣本以及空白對照擴(kuò)增曲線均在閾值水平以下，只有日本血吸蟲擴(kuò)增曲線在閾值線以上，并呈指數(shù)狀分布。將以上各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，只有日本血吸蟲泳道出現(xiàn)特異性目的條帶(圖1)。將日本血吸蟲成蟲樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)BLAST序列比對，同源相似度達(dá)到97.4%(75/77)。

2．3Real-time定量PCR的靈敏度 將日本血吸蟲SjR2基因重組質(zhì)粒連續(xù)10倍稀釋11個(gè)梯度，即濃度4.47×100拷貝/μL～4.47×1010拷貝/μL，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，real-time PCR結(jié)果顯示，可檢測到質(zhì)粒最小濃度為4.47×10 拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-3.0987x + 49.158，相關(guān)系數(shù)為0.996 5(圖2)。

2.4Real-time PCR檢測感染兔血清DNA 從組1～組5家兔感染后3 d至7周的外周血清中提取的DNA模板，每份樣本3個(gè)復(fù)孔，real-time定量PCR檢測結(jié)果分析顯示：組1在感染后第2周的血清樣本中開始測到目的DNA，濃度為119.03拷貝；組2在感染后第1周的血清樣本開始測到目的DNA，濃度為54.36拷貝；組3在感染后第1周的血清樣本開始測到目的DNA,濃度為72.24拷貝；組4和組5在感染后第3 d即可檢測到目的DNA，濃度分別為60.34和142.47拷貝。表2為不同感染度家兔血清中日本血吸蟲DNA的早期檢測時(shí)間及血清中DNA含量的動態(tài)變化。表3為不同感染度家兔血清DNA檢測的時(shí)間節(jié)點(diǎn)及其DNA含量。圖3顯示的為不同感染度家兔血清DNA動態(tài)變化。圖4為血吸蟲感染家兔血清DNA水平與感染度的相關(guān)性。

圖1(A)Real-timePCR特異性擴(kuò)增曲線

(B)Real-timePCR電泳結(jié)果

M: 標(biāo)準(zhǔn)marker; 1: 日本血吸蟲成蟲; 2: 曼氏血吸蟲成蟲; 3: 華支睪吸蟲成蟲; 4: 旋毛蟲成蟲; 5: 衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲; 6: 正常家兔血清; 7: 健康人血清; 8: 空白對照

Fig.1(A)Amplificationplotofreal-timePCRforspecificity

(B)Resultsofelectrophoresisforproductsofreal-timePCR

M:Standard marker; 1:S.japonicum;

2:S.mansoni; 3:C.sinensis; 4:T.spiralis;

5:P.westermani; 6: Sera of normal rabbit;

7: Sera of healthy person; 8: Blank control.

圖2(A)Real-timePCR敏感性擴(kuò)增曲線

A-K分別表示4.47×1010拷貝/μL～4.47×100拷貝/μL 11個(gè)10倍連續(xù)稀釋度的擴(kuò)增曲線，其中曲線K在閾值線以下;

圖2(B)CT值與拷貝數(shù)對數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.2(A)Amplificationplotofreal-timePCRforsensitivity

A-K respectively represent the amplification plot with 10-fold dilution series of plasmid ranging from 4.47×1010-4.47×10copies, the curve of K was below the threshold.

Fig.2(B)StandardcurveforCtvaluesversuslogoftheplasmid

圖3組1～組5家兔血清DNA動態(tài)變化

Fig.3DynamicchangesoftheserumDNAintherabbitsofgroup1-5

圖4家兔血清DNA水平與感染度的相關(guān)性

Fig.4CorrelationbetweentheserumDNAofrabbitsandinfectiosity

表2Real-timePCR對不同感染度家兔血清中日本血吸蟲DNA的早期檢測時(shí)間及血清中DNA含量的動態(tài)變化

Tab.2TimeofearlydetectionofS.japonicumDNAinseraofrabbitswithdifferentinfectiosityanddynamicchangeofDNAlevelbyreal-timePCR

Group感染后不同時(shí)間血清中DNA含量(拷貝)DNA level in sera for different time points post-infection (copies)3 d1 w2 w3 w4 w5 w6 w7 w1119.03268.73245.31623.63707.77979.15254.36226.16414.87392.37959.181 068.261 229.16372.24396.49667.29632.411 213.171 810.612 448.08460.34140.21648.26838.23902.364 524.496 891.738 947.245142.47303.83824.171 152.361 224.088 214.6410 135.4812 414.28

3 討 論

血吸蟲的核酸檢測技術(shù)已成為近年來血吸蟲病診斷研究的熱點(diǎn)之一[16-20]。本課題組前期研究結(jié)果表明，應(yīng)用普通PCR法、巢式PCR法和LAMP法在日本血吸蟲感染家兔模型的實(shí)驗(yàn)研究中具有較好的早期診斷和療效考核價(jià)值[1-5]。但是，以上核酸診斷技術(shù)僅限于定性檢測，無法評價(jià)血吸蟲病的感染度，因此，研究血吸蟲核酸定量檢測技術(shù)，對于探索血吸蟲感染宿主血清DNA動態(tài)變化規(guī)律[21]，感染度的評價(jià)以及早期診斷與療效考核具有重要意義。

本研究以日本血吸蟲高度重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjR2的77 bp DNA為靶序列建立Taqman real-time qPCR法，檢測靶基因重組質(zhì)粒DNA的靈敏度為44.7拷貝，與本課題組已報(bào)道的來源于SjR2的230 bp靶序列巢式PCR法靈敏度(10.2拷貝)相當(dāng)。特異性評價(jià)發(fā)現(xiàn)，該real-time qPCR法僅對日本血吸蟲模板有擴(kuò)增結(jié)果，而對曼氏血吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲和肺吸蟲的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性。所建立的real-time qPCR法檢測感染兔血清血吸蟲DNA結(jié)果顯示，感染后3 d就可以檢測到日本血吸蟲DNA，各組感染后3 d～7周宿主血清DNA濃度整體上呈上升趨勢。由于感染后4周日本血吸蟲發(fā)育成熟，雌蟲大量產(chǎn)卵，感染5周以后的宿主血清DNA主要來源于崩解的蟲卵[21]，因此，感染5周以后血清DNA濃度明顯升高。不同感染度早期檢測的時(shí)間節(jié)點(diǎn)及其檢測DNA含量分別為，在感染30條尾蚴家兔需在感染后2周才能檢測到目的DNA，其閾值為119.03拷貝，在感染50條尾蚴、100條尾蚴家兔則在感染后1周可檢測到目的DNA，其檢測DNA量分別為54.36拷貝和72.24拷貝，感染200條尾蚴、500條尾蚴家兔最早在感染后3 d即可檢測到目的DNA，其檢測DNA量分別為60.34拷貝和142.47拷貝。研究結(jié)果顯示，宿主血清DNA濃度隨感染度的增大而上升，即宿主血清DNA水平與感染度呈正相關(guān)。

表3不同感染度家兔血清DNA早期檢測時(shí)間節(jié)點(diǎn)及其DNA含量

Tab.3TimepointofearlydetectionofS.japonicumDNAinseraofrabbitswithdifferentinfectiosityandDNAlevel

Group檢測時(shí)間節(jié)點(diǎn)(感染后)Time point for detection (PI)對應(yīng)DNA含量(拷貝數(shù))DNA level (copies)12 wk119.0321 wk54.3631 wk72.2443 d60.3453 d142.47

本研究結(jié)果表明，以日本血吸蟲高度重復(fù)基因SjR2為靶序列的Taqman real-time qPCR法在日本血吸蟲感染家兔模型的診斷中顯示出了較好的檢測敏感性和特異性，并提示日本血吸蟲感染宿主血清DNA濃度與感染度呈正相關(guān)，可用于評價(jià)宿主感染度。

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