O1群霍亂弧菌PFGE分子分型和菌株流行能力關(guān)系研究

陳愛平，楊勁松，李曲文，徐海濱，王靈嵐，鄭金鳳，嚴(yán)延生

福建省自1962年發(fā)生埃爾托型霍亂弧菌(EVC)引起的霍亂以來，疫情起伏不定，先后發(fā)生了幾次較大流行。首次為1962-1964年，流行優(yōu)勢血清型為O1群小川；第2次為1978-1989年，流行優(yōu)勢血清型先為1978年O1群小川型，后轉(zhuǎn)為稻葉型，流行時(shí)間持續(xù)近10年；第3次1994-2000年，流行優(yōu)勢血清型為O1群小川；2005年我省又發(fā)生了O1群稻葉的霍亂流行，疫情僅限于2005年；在福建省50年的霍亂流行過程中病原和流行特征都發(fā)生著改變。為闡明福建省不同時(shí)期、地域、不同血清群霍亂分離菌株間的遺傳聯(lián)系和遺傳多樣性，我們選擇福建省1962-2005年代表性霍亂弧菌，運(yùn)用脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)進(jìn)行分子分型，從細(xì)菌全基因組水平探索霍亂弧菌在福建省傳播及流行規(guī)律；同時(shí)結(jié)合流行病學(xué)資料，根據(jù)疫情流行持續(xù)時(shí)間、相關(guān)疫情病例數(shù)等，分析不同PFGE型(簇)的霍亂菌株的流行能力。

1 材料方法

1.1實(shí)驗(yàn)用菌株 選擇1962-2005年福建省歷次霍亂流行，病人中分離保存的菌種77株；包括3次大流行的菌株(1962-1964年、 1978-1989年， 1994-2000年)、2005年菌株和2001-2003年散發(fā)病例的菌株；實(shí)驗(yàn)用菌株均經(jīng)過血清學(xué)重新復(fù)核鑒定為O1群霍亂弧菌。菌株信息見圖1。

1.2PFGE實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù) PulseNet USA(美國CDC)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，經(jīng)國家CDC實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行PFGE實(shí)驗(yàn)[1]。采用NotI限制性內(nèi)切酶對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行酶切，標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812采用XbaI限制性內(nèi)切酶消化，主要的電泳參數(shù)為電壓梯度6 V/cm，電泳夾角120°，電泳溫度14 ℃；電泳參數(shù)：2 s～10 s，13 h, 20 s～25 s ,6 h(ctxA基因陰性菌株在電泳液中加硫脲，終濃度為50 μmol/L)。

1.3數(shù)據(jù)分析 PFGE圖像導(dǎo)入BioNumerics(version 6.0，Applied Maths，Inc)軟件包進(jìn)行處理，選擇Dice相關(guān)系數(shù)和UPGMA方法，tolerance設(shè)置為1.5%。

1.4試劑儀器 Seakem Gold Agarose PFGE 級(jí)瓊脂糖購自Lonza公司，XbaⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶以及蛋白酶K購自美國NEB公司，BIO-RAD公司的Basic電泳儀、Gel Doc XR+讀膠儀、CHEF MAPPER脈沖場凝膠電泳儀，BioMerieux Vitek公司的DENSIMAT細(xì)菌濁度儀。

2 結(jié) 果

2.177株霍亂弧菌PFGE分子分型結(jié)果 77株1962-2005年霍亂弧菌用NotⅠ酶切并進(jìn)行脈沖場電泳后，DNA片段可得到較好地分離，可見大小不一的電泳條帶，分子量從20～690 kb；菌株條帶數(shù)目在21～26之間。利用Bionumerics軟件的Cluster analysis模塊進(jìn)行聚類分析，菌株間條帶相似度在75.3%～100%之間；按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為61個(gè)PFGE型，其中P1型有6株，P13、P14和P57型各有3株，其余各型為1-2株。根據(jù)TENOVER原則[2]，只有1-3條帶差異的菌株在遺傳上可能有緊密相關(guān)性，按照90%的相似度將部分菌株酶切圖譜劃為同一個(gè)簇，可得到5個(gè)主要的PFGE簇(G1-G5)。見圖1。

圖177株霍亂弧菌PFGE分型結(jié)果

Fig.1NotI-digestedPFGEpatternsof77V.choleraeO1serogroupisolates

2.277株霍亂弧菌PFGE簇不同流行時(shí)期分布 第1次流行的菌株以G5 PFGE簇為主(6/9)，同時(shí)存在G4和G1 PFGE簇；第2次流行的菌株以G1和G4 PFGE簇為主(18/24,6/24),第3次流行的菌株以G3和G4 PFGE簇為主(11/30,10/30)，2005年流行的菌株以G2為主(6/6)，2001-2003年散發(fā)的菌株沒有優(yōu)勢的PFGE簇，具體見表1。

表1 77株1962-2005年霍亂弧菌PFGE 簇不同流行時(shí)期分布情況

2.352株小川血清型PFGE分子分型結(jié)果 52株小川型霍亂弧菌，按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為47個(gè)PFGE型。按照90%的相似度將部分菌株酶切圖譜劃為同一個(gè)簇，可得到4個(gè)主要的PFGE簇，命名為G1(o)-G4(o)，o是小川型(Ogawa)的第一個(gè)字母；具體見圖2。

2.4小川型PFGE 簇不同流行時(shí)期的分布情況 1962-1964年流行的菌株以G4(o)PFGE簇為主(7/9)；1978年流行的菌株以G3(o)PFGE簇為主(6/8)；1994-2000年流行的菌株以G2(o)PFGE簇為主(14/29)；1994-2000年屬于其它型別的小川型菌株有9/29；2001-2003散發(fā)的小川型菌株沒有優(yōu)勢PFGE簇；具體見表2。

2.5稻葉血清型PFGE分子分型結(jié)果 25株稻葉型霍亂弧菌按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為15個(gè)PFGE型。按照90%的相似度將部分菌株酶切圖譜劃為同一個(gè)簇，可得到2個(gè)主要的PFGE簇，命名為G1(i)-G2(i)，i是稻葉型(Inaba)的第一個(gè)字母；具體見圖3。1979-1989年的菌株屬于G1(i) PFGE簇(14/14)，2005年的菌株屬于G2(i)PFGE簇(6/6)；其余年份散發(fā)的稻葉型菌株沒有優(yōu)勢的PFGE簇；具體見圖3。

圖252株小川血清型PFGE分子分型結(jié)果

Fig.2PFGEpatternsof52V.choleraeOgawaserotypestrains

表2 52株小川型霍亂弧菌PFGE簇不同流行時(shí)期分布情況

3 討 論

隨著脈沖場凝膠電泳(PFGE)分子分型技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化以及PulseNet監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的建立，越來越多的公共實(shí)驗(yàn)室逐漸利用該技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行各種細(xì)菌性病原體監(jiān)測。我們對(duì)1962-2005代表性的O1群霍亂病人分離株進(jìn)行PFGE分子分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，按照100%的相似度可將77株菌株酶切圖譜分為61個(gè)PFGE型，沒有集中優(yōu)勢的PFGE型別。PFGE分子分型針對(duì)的是全細(xì)菌的基因組，對(duì)于同一次暴發(fā)流行的菌株，理論上菌株的基因組應(yīng)該表現(xiàn)為100%的相似度；但是針對(duì)長時(shí)間跨年度流行的分離株以及實(shí)驗(yàn)室長期保存的菌株(特別是以保種半固體方式保存的霍亂菌株)，因?yàn)榫暝陂L時(shí)間流行傳播和保存過程可能產(chǎn)生基因變異，即使是有遺傳相關(guān)性的菌株P(guān)FGE分型也不一定表現(xiàn)為100%的相似度；但是這種變異一般不會(huì)產(chǎn)生大的基因組變異。根據(jù)TENOVE原則[1]，PFGE基因型別只有1-3條帶差異的菌株在遺傳上可能有緊密相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照90%的相似度將大部分菌株酶切圖譜劃分為5個(gè)主要的PFGE簇G1-G5，實(shí)際上歸于同一個(gè)簇的菌株大部分是同一次流行的菌株；散發(fā)的菌株沒有顯示優(yōu)勢的簇，表現(xiàn)為各自不同的PFGE型別，提示散發(fā)菌株沒有遺傳上的相關(guān)性。因此對(duì)于PFGE分子分型的結(jié)果分析要結(jié)合收集菌株的流行病學(xué)背景資料、研究菌株的時(shí)間跨度和菌種的保存方式等選擇適當(dāng)?shù)南嗨贫冗M(jìn)行聚類，更能客觀、準(zhǔn)確地反映菌株之間的相關(guān)性。

圖325株稻葉型PFGE分子分型結(jié)果

Fig.3PFGEpatternsof25V.choleraeInabaserotypestrains

從1962-2005年福建省霍亂菌株P(guān)FGE簇不同流行時(shí)期的分布情況可見，前3次流行的菌株既有上一次流行簇的延續(xù)，又有新的優(yōu)勢簇的出現(xiàn)；說明前3次流行的菌株在遺傳上有關(guān)聯(lián)性，但是在長時(shí)間流行過程中產(chǎn)生基因變異出現(xiàn)新的優(yōu)勢簇。相同的優(yōu)勢簇分布于福建省各個(gè)地區(qū)，提示福建省各地區(qū)間的霍亂流行在傳播上有相關(guān)性。

福建以小川型為優(yōu)勢血清型的霍亂流行時(shí)期有1962-1964、1978和1994-2000年[1]；各個(gè)流行時(shí)期均有各自優(yōu)勢的PFGE簇，分別為G4(o)、G3(o)、G2(o)。小川型為優(yōu)勢血清型的3次流行，均造成較多的病例數(shù)(均>1500例)，但是從流行持續(xù)的時(shí)間來看1994-2000年明顯超過1962-1964年和1978年，推測G2(o) PFGE簇的小川型菌株在引起霍亂流行時(shí)間長度能力上要強(qiáng)于G3(o)和G4(o)簇。另外，1994-2000年小川型菌株比其它流行時(shí)期的小川型菌株基因組更具有多樣性，可能原因是由于該次流行的時(shí)間跨度達(dá)10年之久，在長時(shí)間的流行過程中菌株產(chǎn)生了基因變異，特別是到了流行后期；而實(shí)際上歸于其它PFGE型別的9株菌株，有8株是1998-2000年流行后期的菌株。

福建以稻葉為優(yōu)勢血清型的霍亂流行時(shí)期有1979-1989和2005年；1979-1989年稻葉型流行了將近10年的時(shí)間，總發(fā)病數(shù)為22292例，2005年稻葉型引發(fā)的疫情僅限于當(dāng)年，發(fā)病數(shù)310；從疫情的延續(xù)時(shí)間、發(fā)病規(guī)模和引發(fā)的病例數(shù)進(jìn)行比較，1979-1989年都明顯超過2005年；1979-1989年的菌株均歸于G1(i) PFGE簇，2005年的菌株均歸于G2(i) PFGE簇；可以推測G1(i) PFGE簇的稻葉型菌株具有引起長時(shí)間、大規(guī)模霍亂流行的能力；G2(i) PFGE簇的菌株在流行能力上明顯較弱。

本文將O1群霍亂弧菌PFGE分子分型的結(jié)果和流行病學(xué)的背景資料相結(jié)合，對(duì)不同PFGE簇(型)菌株在流行時(shí)間長短、引發(fā)流行規(guī)模的能力等方面，進(jìn)行初步探索，為評(píng)估將來霍亂疫情分離株對(duì)流行趨勢的可能影響積累實(shí)驗(yàn)室研究本底資料。

參考文獻(xiàn)：

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