金黃色葡萄球菌GapC蛋白與鼠傷寒沙門氏菌Flic融合蛋白的構建與免疫原性研究

趙 達，王 鶴，梁宏儒，胡 旭，姜東君，尹 輝，高佳濱，陳為宏，喬 波，朱戰波

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于自然界中，在人和畜禽的皮膚、黏膜、腸道、呼吸道及乳腺中也有寄生，常引起化膿性疾病和毒素性疾病，是一種重要的人畜共患致病菌[1]。在感染性疾病中，S.aureus僅次于大腸桿菌，位居第二。隨著S.aureus耐藥菌株的出現，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，新型高效S.aureus疫苗的研發迫在眉睫。

GapC蛋白一種具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性的蛋白，研究表明人源和牛源S.aureus分離株表面均存在高度保守的GapC蛋白，并且具有高度的同源性[2-3]。本實驗室前期研究結果證明S.aureus的GapC蛋白具有較好的保護力[4]。細菌的鞭毛蛋白是Toll樣受體5(Toll-like receptor 5，TLR5)的配體，通過TLR5能夠激發機體的天然免疫應答，從而發揮免疫佐劑作用[5-6]。Nguyen CT等[7]將鞭毛蛋白與肺炎鏈球菌的保護性蛋白PspA融合表達，誘導了高水平的抗PspA特異性抗體，并且該融合蛋白能夠有效保護小鼠免遭肺炎鏈球菌的攻擊。國內王鶴[8]、潘志明[9]的研究也證明了鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium,S.typhimurium)鞭毛蛋白的佐劑作用。

因此，本研究以鞭毛蛋白為佐劑，融合表達S.typhimurium鞭毛蛋白與S.aureusGapC蛋白，研究該融合蛋白的細胞、體液免疫反應及免疫保護性，為S.aureus疫苗的研制提供一定科學參考。

1 材料與方法

1.1菌株和實驗動物S．aureus標準株Wood46株由黑龍江八一農墾大學預防獸醫學實驗室保存；6～8 w齡昆明系清潔級雌性小鼠，購于中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1.2質粒和試劑 質粒pQE30-Flic、pQE30-GapC和pQE30-Flic-GapC均由本實驗構建；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DMSO購自Amresco公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、TMB、刀豆蛋白A(ConA)購自SIGMA 公司；酶標板為Corning公司產品。

1.3試劑盒 Quick SpotTM小鼠IFN-γ、小鼠IL-4 ELISPOT預包被試劑盒為達科為生物技術有限公司產品；WST-1細胞增殖及毒性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.4重組蛋白的制備 誘導表達FliC、GapC、FliC-GapC重組蛋白，采用鎳柱親和層析的方法對重組蛋白進行純化，在4 ℃條件下將所得純化蛋白用PBS透析24 h以上，期間更換3～5次透析液。然后利用內毒素除去柱Detoxi-GelTM去內毒素。

1.5動物免疫 6～8周齡雌性昆明小鼠隨機分為5組，每組20只，分別為GapC蛋白弗氏佐劑組(GapC蛋白+弗氏佐劑)、Flic-GapC蛋白組、GapC蛋白組、Flic蛋白組及PBS對照組。免疫劑量為100 μg/只，采用背部皮下注射免疫方式，間隔3 w免疫一次，一共免疫2次。

1.6小鼠血清中IgG抗體的檢測 在免疫前進行一次割尾采血，分離血清，用作陰性對照血清；一免后每周采血一次，每組采5只，分離血清。方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度，間接ELISA測定小鼠血清抗體效價。具體步驟如下：用0.05 moL/L pH 9.6碳酸鹽包被緩沖液將GapC蛋白稀釋至適宜濃度，100 μL/孔，4 ℃包被過夜；用PBST洗滌3次后加入200 μL含5%脫脂乳的PBST溶液封閉，37 ℃ 2 h；PBST洗滌3次，將待檢血清樣品分別進行倍比稀釋，同時設立陰性對照和空白對照，100 μL/孔，37 ℃ 1 h；PBST洗滌后，加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，100 μL/孔；洗滌后加入新鮮配制的TMB顯色液，100 μL/孔，室溫避光作用15～20 min；50 μL 2 moL/L 濃硫酸終止顯色；酶標儀檢測OD450的值。樣品OD 值≥陰性血清樣品的OD 值+3s(s為標準方差) 時對應的血清稀釋度為該樣品的效價。

1.7淋巴細胞增殖反應試驗

1.7.1小鼠脾臟淋巴細胞的分離和計數 取二免后14 d小鼠，每組3只，頸椎脫臼處死，75%的乙醇中浸泡2～3 min；無菌取出脾臟，加4～5 mL EZ-SepTMMouse 1×淋巴細胞分離液，用兩個載玻片輕輕研磨；將細胞懸液轉移至10 mL離心管中，加入1 mL無血清 RPMI 1640培養基；1 500 r/min水平離心10 min，輕輕吸出中間的淋巴細胞層，轉移至另一10 mL離心管中，加入4 mL含5%犢牛血清的RPMI 1640培養基，顛倒混勻，1 500 r/min離心10 min，棄去上清，收集細胞；加入1 mL 10%犢牛血清的RPMI 1640培養基，重懸細胞，用0.4%臺盼藍進行計數；調整淋巴細胞濃度為2×106個/mL。

1.7.2T淋巴細胞增殖反應試驗 于96孔細胞培養板加入淋巴細胞懸液，每孔50 μL。每個樣品均設非特異性刺激(ConA)、特異性刺激(S.aureusGapC蛋白)和不加刺激物(RPMI-1640)孔，設3個重復孔。分別加入50 μL ConA(孔內終濃度為5 μg/mL)、S.aureusGapC蛋白(孔內終濃度為10 μg/mL)和RPMI-1640。同時在96孔細胞培養板上設置大于3孔的空白對照(只加100 μL 10 %血 清的R P M I 1640)。37 ℃ CO2培養箱孵育48 h，每孔加入10 μL WST-1，繼續孵育4 h。取出培養板以空白對照孔調零，測量OD450的值，結果以3個孔的平均值表示。

計算刺激指數(stimulation index，SI)：

SI=(刺激孔OD-空白孔OD)/(未刺激孔OD-空白孔OD)。

1.8IFN-γ和IL-4的檢測 采用Elispot方法檢測二免后14 d小鼠脾臟IFN-γ和IL-4特異性分泌細胞，以S.aureusGapC蛋白為刺激原(10 μg/mL)，整個實驗設置一組正對照(PHA)，每一個細胞樣品再設一個負對照(不加刺激物)，整塊板設一個背景負對照(不含細胞，只加培養基和所有的檢測試劑)，試驗中每個處理均設3個重復孔。具體操作步驟參考達科為Mouse INF-γ /IL-4 Precoated ELISPOT Kit試劑盒說明書。

1.9攻毒試驗 在二免后21 d，對免疫組及對照組小鼠腹腔注射攻毒，每組10只，攻毒劑量為1 MLD(2×109CFU)。攻毒后在一周內每日觀察小鼠死亡情況，分析各免疫組重組蛋白的保護率。

2 結 果

2.1重組蛋白的純化結果 由于重組蛋白含有His-tag標簽，所以采用鎳柱親和層析的方法進行純化。純化后的重組蛋白進行12% SDS-PAGE 分析，得到了比較純凈的蛋白，結果見圖1。

2.2血清中GapC蛋白特異的IgG抗體檢測結果 用ELISA 方法對各組小鼠血清中GapC蛋白特異的IgG抗體水平進行了檢測。結果表明GapC蛋白弗氏佐劑組、Flic-GapC蛋白組在二次免疫2周后，抗體效價分別可達1∶128 000和1∶64 000。

分別對實驗組和對照組的小鼠血清按1∶200稀釋，進行間接ELISA試驗，檢測IgG抗體消長水平。試驗結果表明，各免疫組從首次免疫后第3 w開始IgG抗體滴度均有不同程度的提高，且在二次免疫后兩周抗體水平達至最高，然后緩慢下降，對照組無明顯變化，如圖2所示。

圖1純化后的重組蛋白SDS-PAGE電泳結果

M：蛋白質 Marker；1：純化后的GapC蛋白；2：純化后的Flic蛋白；3：純化后的Flic-GapC蛋白.

Fig.1SDS-PAGEofpurifiedrecombinantprotein

M: Protein marker; 1: Purified GapC protein;

2: Purified Flic protein; 3: Purified Flic-GapC protein.

圖2 小鼠免疫血清中抗GapC IgG抗體消長曲線

Fig.2Dynamiccurvesofanti-GapCIgGofimmunizedmouse

2.3T淋巴細胞增殖試驗結果 以GapC蛋白和ConA為刺激原，檢測小鼠二免后14 d淋巴細胞特異性增值情況，結果以刺激指數(SI)來表示，如表1和圖3。其中GapC蛋白弗氏佐劑組、Flic-GapC蛋白組直接刺激指數差異無統計學意義(P>0.05)，但高于對照組。說明鞭毛蛋白具有刺激T淋巴細胞增殖的能力，但不如弗氏佐劑。

表1 免疫組及對照組鼠淋巴細胞細胞刺激指數(SI)

2.4IFN-γ和IL-4的檢測結果 分離二免疫后14 d小鼠的脾淋巴細胞，并制成淋巴細胞懸液。利用Elispot方法測定免疫小鼠脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4的能力，免疫各組斑點數如圖2-4所示。結果表明，Flic-GapC融合蛋白能誘導小鼠脾淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ，但誘導IL-4的能力相對較弱，但與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3免疫組及對照組鼠淋巴細胞細胞刺激指數(SI)

Fig.3Lymphocytescellsstimulateindex(SI)ofvaccineimmunizedandcontrolgroups

圖4免疫組及對照組鼠淋巴細胞細胞因子含量對比(SFC)

Fig.4Concentrationsofcytokinessecretedfromlymphocytesofvaccineimmunizedandcontrolmouse(SFC)

2.5攻毒保護試驗結果 各蛋白免疫組及對照組實驗動物在二免后21 d，用S.aureusWood46株攻毒。攻毒后連續一周記錄實驗動物的死亡狀況，并從死亡小鼠內臟中分離到相應致病菌。結果表明，GapC蛋白弗氏佐劑組、FliC-GapC蛋白組攻毒試驗結果保護率分別為80%和70%，單獨的GapC蛋白組保護率僅為20%，FliC蛋白組以及PBS對照組保護率為0%。

3 討 論

研究表明，細菌的鞭毛蛋白可以被細胞的Toll樣受體5(Toll-like receptor 5)識別。鞭毛蛋白與TLR5受體結合后，啟動骨髓源細胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴的信號轉導途徑，最終激活核內因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)和有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)。NF-κB的激活可引發前炎性因子的合成和釋放，如 TNF-α，IL-6，IL-8，IL-10等，從而產生針對病原微生物的天然免疫應答[10-11]。

本研究中，我們利用鞭毛蛋白的免疫佐劑特點，融合表達S.typhimurium鞭毛蛋白與S.aureusGapC蛋白，結果在二免后，小鼠抗GapC蛋白血清抗體水平顯著高于單獨GapC蛋白組，稍低于GapC蛋白弗氏佐劑組。Karam MR等[12-13]成功表達了Flic同尿道致病性大腸桿菌粘附素FimH的融合蛋白，融合蛋白組抗體水平顯著高于單獨的FimH蛋白組。Huleatt JW等[14]將鞭毛蛋白與卵清蛋白(OVA)融合表達，誘導小鼠產生針對 OVA 的特異性免疫應答。本研究中血清抗體檢測結果與上述研究結果一致，說明鞭毛蛋白在小鼠體內能輔助GapC蛋白產生較高的特異性抗體，Flic-GapC融合蛋白能夠刺激小鼠的體液免疫反應。

正常機體的T淋巴細胞表面具有識別有絲分裂原和抗原的受體，在體外培養時，受到有絲分裂原(PHA或ConA)或特異性抗原刺激后，細胞可以發生增殖。本實驗中即利用重組蛋白對小鼠免疫后，分離二免疫后14 d小鼠的脾臟淋巴細胞，在體外用GapC抗原刺激，測定其淋巴細胞增殖水平來檢測T淋巴細胞的應答功能。結果表明，各免疫組平均刺激指數顯著高于Flic對照組和PBS 對照組(P<0.05)，但GapC蛋白弗氏佐劑組和Flic-GapC蛋白組之間淋巴細胞刺激指數差異不顯著(P>0.05)。說明鞭毛蛋白具有刺激T淋巴細胞增殖的能力。

ELISPOT方法具有較高的敏感性和特異性。本研究中以GapC蛋白為特異性刺激原，檢測免疫小鼠脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4的能力。結果表明，用弗氏佐劑乳化GapC蛋白免疫小鼠后，脾淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4的能力最強，Flic-GapC融合蛋白次之，但與對照組相比差異仍然顯著。說明鞭毛蛋白能夠刺激TH1和TH2免疫應答，Flic-GapC融合蛋白也可以激發小鼠的細胞免疫應答和體液免疫應答。

小鼠攻毒保護試驗顯示，GapC蛋白弗氏佐劑組和Flic-GapC蛋白組具有具有一定的免疫保護效果，保護率分別為80%和70%，而單獨的GapC蛋白組保護率僅有20%，對照組小鼠全部死亡。說明重組融合蛋白Flic-GapC具有良好的免疫原性，免疫小鼠后在一定程度上能夠有效抵抗同源金黃色葡萄球菌的攻擊，具有較好的免疫保護作用。但Flic-GapC蛋白與弗氏佐劑乳化后的免疫效果有待于進一步研究。

綜上所述，Flic-GapC融合蛋白具有較好的免疫原性，能夠誘發小鼠針對GapC蛋白的細胞和體液免疫反應，對金黃色葡萄球菌具有一定的免疫保護作用，可作為S.aureus的疫苗靶向進行深入研究。

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