新疆地區(qū)結核分枝桿菌北京/W系和非北京/W系間五種重要蛋白表達差異的初步研究

李 楓，李 華，梁海燕，黃 藝，米利古，王 仙，李永祥，申愛平，曹帥麗，袁 俐

結核病是一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的慢性感染性疾病，嚴重威脅著人類的健康，其致死率在感染性疾病中位于全球第二，僅次于HIV/AIDS。結核分枝桿菌的流行存在著地域差異，據WHO最新的調查報告顯示[1]，近年來新發(fā)結核病病例最多的是亞洲，占全球新發(fā)病例的60%。中國的結核發(fā)病人數僅次于印度，排名第二，而新疆又為我國結核病疫情的高發(fā)區(qū)。

結核分枝桿菌北京/W系菌株是MTB的一個獨特遺傳譜系，占全球分離株的13%，全世界約有1/3的結核病由該型菌株所致[2]，被認為是一類傳播速度更快、毒力更強[3]、與耐藥密切相關的菌株[4-5]，推測這些特性可能與其內在分子表達的改變有一定的聯系。本研究選取了MTB 5個重要的抗原蛋白，包括HspX，Hsp65，38kDa蛋白，Ag85B和MPT64，從DNA、RNA和蛋白水平比較這5個蛋白在北京/W系與非北京/W系菌株中的表達是否存在差異。

1 材料與方法

1.1菌株和細胞株 MTB標準株H37Rv由北京結核病胸部腫瘤研究所提供；MTB臨床分離株60株，其中北京/W系與非北京/W系菌株各30株, 均收集分離于結核患者的痰液。鼠源性巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2主要儀器和試劑 PCR儀和Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；Smart CyclerⅡ實時熒光定量PCR儀購于美國Cepheid公司；7H9液體培養(yǎng)基購于美國Sigma公司；Taq DNA聚合酶、dNTP購于北京天根生物工程公司；細菌RNA提取試劑盒購于美國Omega公司；逆轉錄試劑盒購于上海東洋紡生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司；結核分枝桿菌16kD、Hsp65、38kDa單克隆抗體和Ag85B多克隆抗體購于美國Abcam公司，MPT64多克隆抗體購于北京博爾邁生物技術有限公司；β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠IgG購于北京中衫金橋生物技術有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。

1.3結核分枝桿菌的分離培養(yǎng)及鑒定 60株臨床分離株均運用鑒別培養(yǎng)基PNB(對硝基苯甲酸)和TCH(噻吩-2-羧酸肼)進行了分支桿菌菌種初步鑒定[6]，并進一步用PCR法擴增16SrRNA 和MTP40進行MTB復合群鑒定，確定為人型結核分枝桿菌[7]。北京/W系結核分枝桿菌經RD105缺失基因檢測法進行鑒定確認[8]。

1.4基因克隆及測序 結核分枝桿菌 DNA制備：取適量細菌于500 μL的雙蒸水中，85 ℃滅活30 min，8 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL TE充分混合，85 ℃水浴30 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。通過GenBank查找5個目的蛋白HspX、Hsp65、38 kDa、Ag85B和MPT64對應的編碼基因hspX、groEL2、psts1、fbpB和mpt64的基因序列，應用primer 5.0軟件設計特異性引物(表1)， PCR擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳驗證正確后測序以檢測目的基因有無突變。引物合成與基因測序均由上海生工生物技術有限公司完成。

1.5MTB總RNA的提取及逆轉錄 取7H9液體培養(yǎng)基中處于對數生長期的菌液3 mL，8 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，棄上清，按照細菌RNA提取試劑盒說明進行操作。用核酸蛋白儀測定mRNA的濃度和純度，調整配平每個樣本mRNA的量，取等量mRNA用于逆轉錄。將mRNA先于65 ℃變性5 min，立即置于冰上。逆轉錄體系為primer mix 0.5 μL，逆轉錄酶0.5 μL，Buffer 2.0 μL，RNA 1.0 μL，無Rnase H2O 6.0 μL。37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，逆轉錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6實時定量PCR樣品檢測：應用primer 5.0軟件設計5個目的基因和內參基因Siga的特異性引物(表2)用于實時熒光定量PCR，擴增產物長度為100-300 bp。qRT-PCR反應體系：SYBR Premix 10 μL，H2O 7 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL。每個樣品重復檢測3次。

表1 基因測序的引物序列

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.7總蛋白的制備 結核分枝桿菌感染巨噬細胞RAW264.7 24 h后，收集細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS洗滌3次。按照每106個細胞加入250 μL高效RIPA裂解液(細胞裂解液∶PMSF=100∶1)，靜置30 min。超聲破碎1 min，振幅70%，超聲1 s，停止1 s。14 000 r/min，4 ℃離心25 min，取上清。用核酸蛋白儀測定蛋白濃度，調整配平每個樣本的蛋白量。

1.8Western blot檢測蛋白表達 將蛋白于100 ℃變性5 min，取50 μg蛋白上樣，以β-actin為內參進行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠和12%分離膠)，通過半干轉印法轉移至PVDF膜上，于5%脫脂牛奶中封閉2 h，一抗4℃孵育過夜(結核分枝桿菌16 kD單克隆抗體1∶2 000稀釋， Hsp65單克隆抗體1∶100稀釋，38 kDa單克隆抗體1∶5 000稀釋，Ag85B多克隆抗體1∶5 000稀釋，MPT64多克隆抗體1∶1 000稀釋，β-actin單克隆抗體1∶1 000稀釋)，TBST洗膜5次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h(1∶5 000稀釋)，TBST充分洗膜，ECL顯色曝光。

1.9統(tǒng)計學分析 結果運用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，五種重要蛋白在北京/W系和非北京/W系結核分枝桿菌間的比較分析采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1基因測序分析 結核分枝桿菌標準株H37Rv及臨床分離株北京/W系與非北京/W系菌株的5個目的蛋白HspX、Hsp65、38kDa蛋白、Ag85B和MPT64對應的編碼基因hspX、groEL2、psts1、fbpB和mpt64 PCR擴增產物進行測序，在GenBank中進行Blast比對，結果與標準株同源性為100%，未檢測到基因突變。

2.2mRNA水平的相對表達 實時熒光定量PCR的結果采用相對定量法2-ΔΔCt值比較結核分枝桿菌臨床分離株北京/W系與非北京/W系菌株不同基因mRNA的表達量(表3)。校正結果以非北京/W系菌株mRNA的表達量為1，北京/W系菌株與之比較(圖1)。結果顯示北京/W系菌株38kDa蛋白、Ag85B對應的編碼基因psts1、fbpBmRNA的表達水平低于非北京/W系菌株，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HspX、Hsp65和MPT64對應的編碼基因hspX、groEL2和mpt64 mRNA的表達水平與非北京/W系菌株相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 結核分枝桿菌 mRNA的表達量

圖1北京/W系和非北京/W系MTBmRNA的相對表達水平

注：*表示北京/W系與非北京/W系結核分枝桿菌比較差異顯著(P<0.05)

Fig.1ThemRNArelativeexpressionlevelinBeijing/Wlineageandnon-Beijing/WlineageofMTB

The difference between Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage strains is significant (P<0.05).

2.3蛋白表達水平 Western blot檢測細菌感染巨噬細胞RAW264.7 24 h后結核分枝桿菌臨床分離株北京/W系與非北京/W系菌株蛋白HspX、Hsp65、38 kDa蛋白、Ag85B和MPT64的表達水平。結果用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目的條帶的灰度值和對應樣本β-actin的灰度值的比值代表蛋白的相對表達量(表4，圖2)。

結果顯示細菌感染細胞24 h后，北京/W系菌株HspX、Hsp65的表達水平高于非北京/W系菌株，38 kDa蛋白、Ag85B的表達水平低于非北京/W系菌株，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MPT64的表達未見差異(P>0.05)。

圖2北京/W系和非北京/W系MTB蛋白表達水平的比較

注：*表示北京/W系與非北京/W系結核分枝桿菌比較，P<0.05

Fig.2ComparisononexpressionleveloftheproteininBeijing/Wlineageandnon-Beijing/WlineageofMTB

The difference between Beijing/W lineage and non-Beijing/W lineage strains is significant (P<0.05).

3 討 論

結核分枝桿菌是胞內寄生菌，不產生內、外毒素及侵襲性酶，其致病性可能與細菌在組織細胞內大量繁殖引起的炎癥，菌體成分和代謝物質的毒性以及機體對菌體成分產生的免疫損傷有關，而MTB分泌的蛋白及菌體蛋白在宿主抗MTB的免疫反應中發(fā)揮著重要的作用。北京/W系MTB在全球廣泛分布并造成多次爆發(fā)流行，推測其傳播高毒力性與其內在蛋白分子表達的改變有一定的聯系。

表4 結核分枝桿菌蛋白的表達量

HspX又稱α晶體蛋白，是由MTB的hspX基因編碼的一個重要的膜抗原。實驗研究表明，HspX是MTB潛伏感染期機體免疫反應的重要靶抗原，對MTB進入休眠狀態(tài)及MTB休眠菌在體內存活起著重要的作用，并且有基因敲除實驗表明如果沒有HspX，MTB將很難在宿主巨噬細胞內存活[9]。在結核潛伏期HspX高度表達，積累成為潛伏期細菌表達的主要蛋白質，該蛋白作為分子伴侶避免其他蛋白因熱誘導而降解, 可能在MTB長期持留中起穩(wěn)定細胞壁結構的作用，與MTB緩慢生長有關[10-11]。Hsp65是Hsp60家族成員之一，由gorEL2基因編碼的分泌蛋白，具有高度的保守性。該蛋白具有很強的免疫原性，在結核分枝桿菌感染過程中，Hsp65是機體對抗其入侵的重要的免疫保護性抗原，在MTB感染的小鼠體內，約20%的反應性T細胞能夠識別Hsp65[12]。本研究結果顯示，細菌感染巨噬細胞24 h后，北京/W系菌株中HspX和 Hsp65蛋白的表達量均高于非北京/W系菌株，而感染細胞前mRNA的表達水平沒有差異。推測可能是因為熱休克蛋白高度保守，在正常的生理條件下表達水平較低，當被巨噬細胞吞噬后進入應激狀態(tài)被大量誘導表達以發(fā)揮重要的作用。HspX的高表達有利于北京/W系菌株在宿主體內生存，賦予其更高的毒力和更強的抵抗性。但是對機體具有較強免疫保護作用的Hsp65在細菌感染細胞24h后在北京/W系菌株中也呈高表達，其具體作用機制有待進一步研究。

38 kDa蛋白是由psts1基因編碼的一種磷酸鹽轉運蛋白，可能與胞內抗結核藥物外排有關[13]。該蛋白以分泌蛋白和膜蛋白的形式存在, 能介導宿主巨噬細胞的凋亡，與凋亡受體TNFR1、TNFR2和Fas的表達上調密切相關[14]。此外該蛋白含有供T、B淋巴細胞識別的抗原表位，可以誘導機體產生較強烈的體液免疫和細胞免疫[15]。Ag85B是由fbpB基因編碼的一種分泌蛋白，屬于Ag85復合物(包括Ag85A，B，C)的組分之一，抗原分析表明三者中Ag85B的免疫原性最強，是BCG發(fā)揮生物學作用的主要成分，能誘導機體產生強烈的Th1免疫反應[16]，Ag85B還可誘導PPD陽性健康人群外周血單個核細胞分泌IFN-γ，具有較強的免疫保護作用[17]。MPT64是由mpt64基因編碼的一種結核分枝桿菌早期分泌蛋白，是機體抗MTB感染的保護性抗原，具有重要的細胞免疫功能。本研究結果顯示，在北京/W系菌株中38kDa、Ag85B的mRNA和蛋白表達水平均低于非北京/W系菌株，二者均為免疫保護性蛋白，它們的低表達有助于北京/W系菌株逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和清除，提高了細菌的生存能力。而MPT64的表達未見差異。

北京/W系結核分枝桿菌在世界范圍內廣泛傳播，具有更高的毒力和更強的抵抗性，可引起非保護性免疫并抑制和逃避宿主免疫，其特性與特有的蛋白分子表達有關。但是北京/W系菌株的流行是多因素綜合作用的結果，其在體內的感染機制尚需進一步深入探索。

參考文獻：

[1]WHO. Global tuberculosis control report[R]. Geneva: World Health Organization, 2012.

[2]Brudey K, Driscoll JR, Rigouts L, et al.Mycobacteriumtuberculosiscomplex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology[J]. BMC Microbiol, 2006, 6: 23. DOI: 10.1186/1471-2180-6-23

[3]Zhang M, Gong J, Yang Z, et al. Enhanced capacity of a widespread strain ofMycobacteriumtuberculosisto grow in human macrophages[J]. J Infect Dis, 1999, 179(5): 1213-1217.DOI: 10.1086/314738

[4]Dong DD, Gao Q.Mycobacteriumtuberculosisgenetic diversity and differential virulence[J].Microbes Infect, 2010, 5(2): 106-110. (in Chinese)

董丹丹, 高謙. 結核分枝桿菌進化與致病性的研究[J]. 微生物與感染, 2010, 5(2): 106-110.

[5]Liu BB, Lu LP, Lü B, et al. Meta analysis on the correlation betweenMycobacteriumtuberculosisBeijing family strains and drug resistance[J]. Chin J Prev Med, 2012, 46(2): 158-164. (in Chinese)

劉彬彬, 盧亮萍, 呂冰, 等. 結核分枝桿菌北京家族菌株與耐藥相關性研究的Meta分析[J]. 中華預防醫(yī)學雜志, 2012, 46(2): 158-164.

[6]Chinese Anti-tuberculosis Association. The laboratory science procedure of diagnostic bacteriology in tuberculosis[J]. J Chin Anti-tuberculosis, 1996, 18(1): 28-31; 1996, 18(2): 80-85; 1996, 18(3): 127-134. (in Chinese)

中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程[J].中國防癆雜志,1996,18(1):28-31；1996, 18(2):80-85;1996,18(3):127-134.

[7]Huard RC, Lazzarnil C, Butler WR, et al. PCR based method to differentiate the subspecies of theMycobacteriumtuberculosiscomplex on the basis of genomic deletion[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(4): 1637-1650. DOI: 10.1128/JCM.41.4.1637-1650.2003

[8]Tsolaki AG, Gagneux S, Pym AS, et al. Genomic deletions classify the Beijing/W strains as a distinct genetic lineage ofMycobacteriumtuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(7): 3185-3191. DOI: 10.1128/JCM.43.7.3185-3191.2005

[9]Fu X, Zhang H, Zhang X, et al. A dual role for the N-terminal region ofMycobacteriumtuberculosisHsp16.3 in self-oligomerization and binding denaturing substrate proteins[J]. J Biol Chem, 2005, 80(8): 6337-6348. DOI: 10.1074/jbc.M406319200

[10]Shi CH, Jiang Y, Zhao Y, et al. Effects ofMycobacteriumtuberculosisHsp16.3 protein on the autophagy function of mice macrophages[J]. Chin J Cell Mol Immunol, 2011, 27(12): 1301-1303. (in Chinese)

師長宏, 江鷹, 趙勇, 等. 結核分枝桿菌Hsp16.3蛋白影響小鼠巨噬細胞自噬形成的實驗研究[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2011, 27(12): 1301-1303.

[11]Daniel J, Maamar H, Deb C, et al.Mycobacteriumtuberculosisuses host triacylglycerol to accumulate lipid droplets and acquires a dormancy-like phenotype in lipid-loaded macrophages[J]. PloS Pathog, 2011, 7(6): e1002093. DOI: 10.1371/journal.ppat.1002093

[12]Lowrie DB, Tascon RE, Bonato VL, et al. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination[J]. Nature, 1999, 400(6741): 269-271. DOI: 10.1038/22326

[13]Bhatt K, Banerjee SK, Chakraborti PK. Evidence that phosphate specific transporter is amplified in a fluoroquinolone resistantMycobacteriumsmegmatis[J]. Eur J Biochem, 2000, 267: 4028-4032. DOI: 10.1046/j.1432-1327.2000.01437.x

[14]Sanchez A, Espinosa P, Esparza MA, et al.Mycobacteriumtuberculosis38-kDa lipoprotein is apoptogenic for human monocyte-derived macrophages[J]. Scand J Immunol, 2009, 69(1): 20-28. DOI: 10.1111/j.1365-3083.2008.02193.x

[15]Wu X, Yang X, Zhang J, et al. Humoral immune responses against theMycobacteriumtuberculosis38-kilodalton, MTB-48, and CFP-10/ESAT-6 antigens in tuberculosis[J]. Clin Vaccine Immunol, 2010, 17(3): 372-375. DOI: 10.1128/CVI.00287-09

[16]Lim JH, Park JK, Jo EK, et al. Purification and immunoreactivity of three components from the 30/32-Kilodalton antigen85 complex inMycobacteriumtuberculosis[J]. Infect Immune, 1999, 67(11): 6187-6190.

[17]Torres M, Herrera T, Villareal H, et al. Cytokine profiles for peripheral blood lymphocytes from patients with active pulmonary tuberculosis and healthy household contacts in response to the 30-kilodalton antigen ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Infect Immun, 1998, 66(1): 176-180.