豬鼻支原體黏附宿主細胞間接免疫熒光檢測方法的建立

紀 燕，熊祺琰，韋艷娜，馬慶紅，白方方，馮志新，劉茂軍，邵國青

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)是第一種從豬體內分離得到支原體[1]，可引起豬的肺炎、多發性漿膜炎、關節炎、中耳炎等臨床癥狀,導致保育豬、育肥豬等生長性能下降，, 對養殖業造成巨大危害[2-4]。Mhr也是人類和多種動物細胞培養中常見的污染物[5]，同時近年來許多研究證實其與多種人類腫瘤的發生有明顯的相關性[6-7]。目前，有關Mhr的研究較少，其與宿主之間的關系、發病機制、免疫逃避機制以及不同毒株的致病力差異等諸多問題尚未定論。Mhr對宿主細胞的黏附是其侵入機體的第一步也是關鍵的步驟[8-9]，因此對于Mhr黏附細胞機制的深入研究至關重要，可為疾病病因闡釋及疫苗研發奠定基礎。本研究建立的Mhr黏附宿主細胞的間接免疫熒光檢測方法為利用體外感染細胞模型研究Mhr黏附、侵染宿主細胞以及其黏附因子等的研究奠定基礎。

1 材料及方法

1.1菌株、細胞及試劑 豬鼻支原體10071603株及豬腎上皮細胞PK15均由江蘇省農業科學院獸醫研究所家畜疾病防控研究室保存。

兔抗Mhr多抗由實驗室自制，用Mhr全菌抗原免疫新西蘭大白兔，共免疫三次，每次間隔2周，第三次免疫后2周采血，制備血清后，用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，PBS透析后分裝于-20 ℃凍存，效價測定為1∶51 200；FITC-羊抗兔IgG，購自武漢博士德生物工程有限公司；DMEM,購自Gibco公司；小牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司。

1.2Mhr培養 Mhr10071603株以1∶10比例接種于含20%豬血清的KM2培養基，待菌液生長至對數生長期時備用。

1.3PK15細胞培養 PK15細胞用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL的DMEM培養液培養，待細胞匯合至90%以上時，胰蛋白酶消化。細胞以2×104個/孔接種于96孔細胞板，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。

1.4Mhr黏附細胞 取4 mL新鮮培養的處于對數生長期的Mhr,12 000 r/min離心30 min。菌體沉淀用PBS洗滌一次，DMEM維持液(含2%的小牛血清)重懸菌體備用。96孔板中的細胞用PBS洗滌一次。將DMEM維持液重懸的Mhr菌體按100 μL/孔接種于鋪有細胞的細胞板中，于37 ℃黏附一定時間。用PBS洗滌未黏附的Mhr，洗滌3次，每次5 min。冰乙醇4 ℃固定30 min,100 μL/孔。

1.5間接免疫熒光試驗程序 冰乙醇固定后的96孔板用PBS洗滌3次，每次5 min；用1% BSA 4 ℃封閉過夜；次日用PBS洗板3次，每次5 min；然后加入100 μL 1∶100稀釋的兔抗Mhr多抗，于37 ℃孵育1.5 h；用PBS洗板4次，每次5 min；然后加入50 μL 1∶50稀釋的熒光二抗FITC-羊抗兔IgG, 于37 ℃避光孵育1 h；然后用PBS洗板5次， 每次5 min。最后將細胞板置于倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

1.6間接免疫熒光試驗最佳工作條件的確定 以下試驗分別對黏附滴度、黏附時間、一抗工作濃度及二抗工作濃度4個指標進行優化，每次僅改動一個變量。

1.6.1Mhr 黏附滴度的確定 用顏色改變單位法(Colour chang unit,CCU)測定DMEM維持液重懸的Mhr的滴度。同時將DMEM維持液重懸的Mhr菌液按10倍系列稀釋接種于鋪有細胞的孔中，孵育6 h后,進行IFA試驗，其它條件同上述反應程序。觀察Mhr滴度對試驗結果的影響。

1.6.2Mhr黏附時間的確定 Mhr黏附PK15細胞的時間分別采取1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，進行IFA試驗，其它條件同上述反應程序。觀察黏附時間對試驗結果的影響，確定最適的Mhr黏附時間。

1.6.3一抗工作濃度的確定 將純化的兔抗Mhr多抗(效價為1∶51 200)進行1∶10、1∶100、1∶500、1∶1 000倍稀釋，進行IFA試驗，其它條件同上述反應程序，觀察比較不同稀釋度對試驗結果的影響，確定最佳的一抗工作濃度。

1.6.4二抗工作濃度的確定 以上述確定的最佳抗體稀釋度作為一抗的工作濃度，分別將市售熒光二抗作1∶100、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400倍稀釋，其它條件同上述反應程序，進行IFA試驗，測定呈現明顯熒光強度的最大稀釋倍數，確定最適的二抗工作濃度。

2 結 果

2.1Mhr 黏附滴度的確定 試驗結果表明，1×109CCU/mL、1×108CCU/mL的Mhr與PK15作用6 h，可見大量的Mhr黏附于細胞；1×107CCU/mL的Mhr與PK15作用6 h,有較多量的Mhr黏附于細胞；1×106CCU/mL與PK15作用6 h,僅少量的Mhr黏附于細胞、1×105CCU/mL的Mhr與PK15作用6 h,與陰性對照區別不明顯。表明Mhr黏附PK15細胞的最小滴度為1×107CCU/mL(圖1)。

2.2Mhr黏附時間的確定 試驗結果表明，當Mhr與PK15作用1 h時，僅有少量Mhr黏附于細胞表面；當作用4 h時，黏附的Mhr明顯增多，作用6 h和8 h時可看到大量的Mhr黏附于細胞表面。而當作用到達10 h時，細胞開始出現一定的脫落，這可能與Mhr對細胞的感染損傷有關。當間接免疫熒光試驗用于研究Mhr對細胞黏附作用時，可選擇作用6～8 h(圖2)。

2.3一抗工作濃度的確定 試驗結果表明，當一抗以1∶10、1∶100稀釋時，特異性熒光強度高；當一抗以1∶500、1∶1 000稀釋時，特異性熒光強度相當較弱，考慮試驗的操作性和便利性，確定一抗的最佳工作濃度為1∶100(圖3)。

圖1不同滴度的Mhr與PK15的黏附作用

Fig.1AdherenceofMhrwithdifferenttiterstoPK15cells

Titers adhesion to PK15 cells are shown.

A: 1×109CCU/mL; B: 1×108CCU/mL; C: 1×107CCU/mL; D: 1×106CCU/mL; E: 1×105CCU/mL;

F: Negative control.

圖2Mhr與PK15作用不同時間對黏附作用的影響

Fig.2AdherenceofMhrtoPK15cellsaffectedbyreactiontime

Results of Mhr adhesion to PK15 cells for 1 hour (A), 2 hours (B), 4 hours (C), 6 hours (D), 8 hours (E), and 10 hours (F) are shown. G: Negative control

2.4二抗工作濃度的確定 試驗結果表明，當二抗以1∶100、1∶400、1∶800、1∶1 600稀釋時，特異性熒光強度依次降低，但整體仍維持在較好水平；當二抗以1∶3 200、1∶6 400稀釋時，特異性熒光強度相當較弱，因此二抗的最佳工作濃度確定為1∶1 600(圖4)。

圖3一抗工作濃度對熒光效果的影響

Fig.3Influenceofdifferentdilutionoffirstantibodytofluorescenteffect

Results of 1∶10 (A), 1∶100 (B), 1∶500 (C), and 1∶1 000 (D) dilution of first antibody to fluorescent effect are shown. E: Negative control.

圖4二抗工作濃度對熒光效果的影響

Fig.4Influenceofdifferentdilutionofsecondantibodytofluorescenteffect

Results of 1∶100 (A), 1∶400 (B), 1∶800 (C), 1∶1 600 (D), 1∶3 200 (E), and 1∶6 400 (F) dilution of second antibody to fluorescent effect are shown. G: Negative control

3 討 論

目前，關于Mhr黏附宿主細胞及感染致病機制的研究較少。William[10]等人在早期發現大多數Mhr菌株能夠黏附到原代豬腎細胞質膜表面，通過聚集一定數量損害細胞質膜，引起細胞顆粒狀、胞漿濃縮等細胞質損傷特征，但對細胞核未造成直接損害，該發現為Mhr感染細胞相關方面的研究提供思路。但目前對于Mhr的黏附因子尚未見報道。另一方面，Jonathan D[11]等人認為，Mhr僅黏附于細胞表面并不能造成細胞的發病，宿主細胞與入侵的Mhr之間互作信號的產生是造成細胞損傷的關鍵。

本研究建立的Mhr黏附PK15細胞的間接免疫熒光檢測方法為Mhr感染細胞機制的體外研究提供了基礎方法。用兔體制備的Mhr免疫血清純化多抗為一抗，未觀察到明顯的由交叉反應導致的本底偏高的現象，說明直接用多抗進行Mhr黏附細胞的間接免疫熒光檢測是可行的，避免了單抗制備以及單抗反應效果可能不佳的問題。經結果分析發現，當Mhr與PK15細胞作用達到10 h時，相較于孵育6、8 h的細胞數量發生了一定降低，鏡檢觀察細胞狀態變差，如果繼續作用更長的時間，細胞會出現更明顯的脫落情況。這很可能與Mhr逐步地對細胞進行體外感染、影響細胞生長狀態有關。因此，如果單純研究Mhr對細胞的黏附情況，或者對其黏附因子進行研究，將孵育時間控制在8 h以內，可以保持較好的細胞形態，而如果要研究Mhr對細胞的侵染、與細胞的相互作用等，可以考慮選擇更加長的作用時間，能夠較明顯地觀察細胞的變化。

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