抗EV71病毒人源抗體Fab段表達基因的構建及序列分析

余艷瓊，翁育偉,2，嚴延生，2

腸道病毒71型(Human enterovirus 71，EV71)是引起手足口病(hand foot mouth disease，HFMD)的主要病原體之一[1]，其感染傳播途徑復雜，可通過消化道、呼吸道、密切接觸等多種途徑傳播。人群對EV71型腸道病毒普遍易感，成人多因隱性感染獲得免疫力，因此感染者主要為學齡前兒童，其中部分患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等嚴重并發癥，甚至導致死亡。近幾年，HFMD在亞太地區廣泛流行，對兒童的健康成長造成嚴重威脅，成為政府和社會高度關注的公共衛生問題。盡管EV71疫苗研究已經取得重要進展[2]，但臨床上還沒有針對EV71感染的特效抗病毒藥物。特異性抗體是臨床治療病毒性感染的重要手段之一[3]，其中人源性抗體因其可以避免患者產生人抗鼠抗體(Human anti-mouse antibody，HAMA)反應[4]，成為目前研制各類治療性抗體的主要方向。本研究從EV71成人感染者外周血淋巴細胞中分別調取IgG輕、重鏈可變區基因，經重疊PCR構建人IgG抗體的Fab段，為進一步構建人源化的EV71病毒單克隆抗體庫奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1人外周血淋巴細胞 由EV71病毒血清中和抗體陽性且免疫功能健全的成人外周血中分離。

1.1.2毒株和噬菌粒 EV71病毒分離株(LY008)由本實驗室分離并保存。含人IgG抗體重鏈及輕鏈恒定區序列的pComb3XTT 和 pComb3Xλ噬菌粒由本實驗室保存。

1.1.3引物 擴增使用的引物參照Andris-Widhopf等[5]的文獻，其中擴增重鏈可變區(heavy chain variable region , VH)基因的引物12對，擴增kappa鏈(kappa chain variable region, Vκ)基因的引物4對，擴增lamda鏈(lamda chain variable region, Vλ)基因的引物9對，擴增重、輕鏈恒定區CH1、Cκ、Cλ基因的引物各一對，用于kappa及lamda鏈序列拼接的引物各一對，用于Fab鏈序列基因片段的引物一對，以上引物均由TaKaRa公司合成。

1.1.4主要試劑 人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品公司；TRIzol?LS Reagent、逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司；高保真PCR擴增試劑盒購自Roche公司；柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自TIANGEN公司；柱式膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；DNA Marker 、T-Vector pMD20、JM109感受態細胞購自TaKaRa公司；BigDye?Terminator測序試劑盒購自ABI公司，其他試劑均為實驗室常規試劑。

1.1.5主要儀器 Beckman臺式高速冷凍離心機、Applied Biosystems 3500/3500 XL遺傳分析儀、Bio-Rad 水平電泳儀、Biometra Tg PCR儀、NanophotometerTMPeal超微量紫外可見分光光度計、BOX化學發光熒光凝膠成像系統、恒溫培養箱、恒溫搖床。

1.2方法

1.2.1人EV71病毒血清中和抗體滴度的測定 從20名健康成人抽取少量外周血(3 mL)，分離血清，以EV71病毒分離株為抗原，檢測EV71病毒中和抗體滴度[6]。從中篩選出1名血清中和抗體滴度為1∶128的成人，抽取其外周血50 mL，置于肝素瓶中備用。

1.2.2cDNA的合成 用淋巴細胞分離液常規分離上述外周血淋巴細胞，重懸于PBS液并作細胞計數，共獲得2.8×108個淋巴細胞，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，并以其為模板，以Oligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈。

1.2.3重、輕鏈可變區及恒定區基因擴增 以上述制備好的 cDNA 為模板，運用溫度梯度 PCR確定重鏈與輕鏈擴增的退火溫度，在相對應的VH、Vκ和Vλ引物作用下，分別擴增出不同亞群的VH、Vκ和Vλ基因；以 pComb3XTT 噬菌粒為模板，用CH1和Cκ引物按上述方法 PCR 擴增重鏈恒定區 CH1和 Cκ基因；以 pComb3Xλ 噬菌粒為模板，以Cλ引物擴增輕鏈Cλ恒定區基因。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，進行膠回收并定量，用以進行重疊PCR(Splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)。

1.2.4重疊PCR 分別以等摩爾比混合VH 和CH1回收產物、Vκ和Cκ回收產物、Vλ和Cλ回收產物，并分別使用Lead VH和dpseq引物、RSC-F和Lead-B引物進行重疊PCR，獲得Fd基因(重鏈)和kappa及lamda基因(輕鏈)。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后進行回收純化，將回收的kappa及lamda基因片段混合后即得到輕鏈基因庫。取純化的Fd及輕鏈基因片段各約100 ng，不加引物，經94℃預變性5 min，94℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 3 min，10個循環后，4℃ 2 min，加引物RSC-F(sense) 和dp-EX(reverse)，94℃預變性2 min，94℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸 3 min，72℃ 10 min，20個循環后，獲得Fab基因片段，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，凍于-20℃待用。

1.2.5Fab基因片段克隆及多樣性鑒定 通過TA克隆的方法，將純化后Fab基因片段重組到T-Vector pMD20T載體中，并將該重組質粒轉化至JM109感受態細胞中，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB-瓊脂平板培養基上過夜培養。次日隨機挑選白色菌落，接種含Amp的LB-液體培養基，提取質粒，分別用引物M13 primer RV(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)和引物M13 primer M4(5′-GTTTTCCCAGTCACGA-3′)進行測序。測序結果運用DNASTAR軟件進行分析，確定輕、重鏈可變區序列后與IMGT/V-QUEST數據庫(http: //imgt.org)比對，確定輕、重鏈序列的家系，并計算Fab段基因的多樣性。

2 結 果

2.1抗體輕、重鏈可變區和恒定區基因的擴增及鑒定 以cDNA為模板，成功擴增出12條VH基因、4條Vκ基因和9條Vλ基因，擴增的產物分子量符合預期要求，結果分別見圖1,2,3。分別以pComb3XTT、pComb3Xλ為模板，擴增得到CH1、Cκ、Cλ片段，大小約為350～400 bp，與預期相符。

圖1人源抗體VH基因PCR產物

M: 100 bp DNA marker; 1-12:VH基因12對引物PCR擴增產物

Fig.1PCRproductsofhuman-originVHgenes

M: 100 bp DNA marker; 1-12: PCR products of VH genes by 12 pairs of human IgG primers.

圖2人源抗體Vκ基因PCR產物

M: 100 bp DNA marker; 1-4: Vκ基因4對引物PCR擴增產物

Fig.2PCRproductsofhuman-originVκgenes

M: 100 bp DNA marker; 1-4: PCR products of Vκ genes by 4 pairs of human IgG primers.

2.2重疊PCR結果及鑒定 采用重疊PCR法，分別混合VH 和CH1、Vκ和Cκ、Vλ和Cλ純化片段，運用對應的引物，擴增后分別獲得Fd基因、kappa及 lamda基因片段，大小約750～800 bp，結果見圖4。等量混合純化后的Fd及輕鏈基因片段(含kappa和lamda)，經重疊PCR擴增后獲得完整的Fab片段，大小約為1 500 bp，電泳結果見圖5。上述重疊PCR所獲得的片段大小均符合預期。

圖3人源抗體Vλ基因PCR產物

M: 100 bp DNA marker; 1-9: Vλ基因9對引物PCR擴增產物

Fig.3PCRproductsofhuman-originVλgenes

M: 100 bp DNA marker; 1-9: PCR products of Vλ genes by 9 pairs of human IgG primers.

圖4抗體Fd、kappa及lamda基因PCR純化產物

M: 100 bp DNA marker; 1:lamda基因PCR純化產物; 2:κappa基因PCR純化產物; 3: Fd基因PCR純化產物

Fig.4PurifiedPCRproductsofFd,kappaandlamdachaingenes

M: 100 bp DNA marker; 1: PCR products of lamda chain genes; 2: PCR products of kappa chain genes; 3: PCR products of heavy chain Fd genes.

圖5抗體Fab基因PCR純化產物

M: 100 bp DNA marker; 1: Fab基因PCR純化產物

Fig.5PurifiedPCRofproductsFabfragment

M: 100 bp DNA marker; 1: PCR products of Fab fragment.

2.3Fab片段測序及多樣性分析 隨機挑取25個白色菌落，接種液體LB，提取質粒。對其中成功插入目的片段的17個重組質粒進行核酸序列測定、拼接，最后獲得17條完整的Fab基因序列。將對應的重、輕鏈可變區基因序列與IMGT/V-QUEST數據庫比對，結果表明它們均為人IgG抗體的Fab基因序列，其中所獲重鏈可變區基因包含了IGHV1-4家系、IGHD1-5家系及IGHJ4-5家系；輕鏈可變區基因的家族包含了IGKV1、4家系、IGKJ1、2、4家系、IGLV1～4家系及IGLJ2-3家系。分析重鏈和輕鏈的多樣性分別為70.59%和76.47%，重、輕鏈組合后其多樣性為94.12%。結果見表1。

表1 Fab片段多樣性

3 討 論

自1975年Kohler和Milstein[7]發明了B淋巴細胞雜交瘤技術，并首次獲得了單克隆抗體(monoclonal antibody, MAb)后，單抗藥物迅速發展并廣泛應用于臨床治療。該方法具有簡便、易篩選、產量高等諸多優點，然而，由于應用該方法所獲得的抗體多為鼠源抗體，對人免疫系統具有較強的免疫原性，可誘發人抗鼠抗體反應[4]，并且此類抗體不能有效地激活人體免疫系統的生物效應功能，因此在臨床應用受到極大限制。鼠源單抗人源化或完全人源性抗體制備技術獲得的抗體可以減少或避免HAMA反應，此類技術制備的抗體已經在腫瘤治療等臨床中得到應用[8]。但目前國內外在制備EV71人源抗體方面的研究甚少。欲構建人源抗體文庫，首先需要考慮的問題是構建單鏈抗體(ScFv)文庫還是Fab抗體文庫，這兩種形式是目前人源抗體文庫的主要形式。ScFv是通過連接肽把抗體重輕鏈的可變區連接起來，其特點是表達產量高，但易形成多聚體。而Fab是一種穩定的、性質明確的蛋白片段，一般不形成多聚體[9]。雖然在大腸桿菌中的表達產量較ScFv低[10]，但它具有與抗原結合的獨立功能，且Fab較ScFv更容易轉化成完整的抗體分子?；谏鲜鲈?，我們選擇了Fab抗體文庫作為人源抗體文庫的構建形式。

為了建立一個高質量、大容量、且能夠篩選出特異性抗體的抗體基因庫，我們在抗體庫基因的來源上進行了篩選。理論上，一個B細胞含有一種抗體基因，人類天然抗體庫的重鏈基因多樣性達到107，輕鏈基因多樣性達到105，只有當淋巴細胞的量達到該數量級，才有可能將每一種抗體基因都擴增出來[11]。本次研究從該名自愿者的外周血中，共分離得到2.8×108個淋巴細胞，其數量級已達到建庫要求，這為成功構建大庫容量的抗體庫奠定了基礎。抗體庫中特異性單抗的含量，不僅取決于抗體庫的容量，同時還與外周血中特異性抗體的含量密切相關。雖然EV71感染后發病患者主要為學齡前兒童，但有統計分析表明[12]嬰幼兒體內EV71保護性抗體水平非常低，而EV71引起的腦膜腦炎患兒體內中和抗體水平與正常兒童并無明顯差異，考慮造成這種現象的原因是嬰幼兒的免疫應答機制不成熟，而且體內淋巴細胞仍處于動態變化中，功能尚不完善，合成抗體能力也較差[13]。故與以往選擇恢復期患兒外周血作為人源中和性EV71抗體來源的相關研究不同，本次研究標本選自EV71中和抗體陽性且免疫功能健全的成人，其外周血更有利于獲得高豐度的EV71腸道病毒抗體表達基因，從而確保了抗體基因庫的高質量。

本次實驗成功完成了所有引物對的擴增，且為了檢驗所獲得的Fab片段的多樣性，我們通過TA克隆，將Fab片段重組到載體中，并將該重組質粒轉化至感受態細胞，隨機挑選陽性克隆，提取質粒進行序列分析，共獲得了17條基因序列。運用MEGA5.0軟件分別找出所對應的重、輕鏈基因序列，將這些序列與IMGT/V-QUEST數據庫比對，結果表明均為人IgG抗體的Fab基因序列，并獲得它們的抗體基因家族信息，其中VH基因家族的分布頻率為：VH1(11.76%)、VH2(11.76%)、VH3 (23.53%)、VH4(52.94%)， VL基因家族的分布頻率為：Vλ1(58.33%)、Vλ2(16.67%)、Vλ3(16.67%)、Vλ4(8.33%)和Vκ1(80%)、Vκ4(20%)。一般認為，VH可分成7個基因家族，VH1～VH7[14]，其中VH3所占比例最高(約45.6%)，而VH5、VH6及VH7表達頻率極低[15]；VL基因家族中，Vκ的功能基因可分為1～5個家族，以Vκ1最多見；Vλ的功能基因可分為11個基因家族，以Vλ3最多見[16]。而在本次研究結果中，VH4相較于VH3表達頻率更高，而在λ輕鏈中Vλ1最多見，出現該現象的原因考慮是不同個體間抗體基因的使用頻率差異造成的。正如Davidkova等[17]運用原位雜交的方法，發現各健康個體之間VH基因家族的使用頻率存在很大差異的結果。最后，經過序列分析發現，擴增所得到Fab基因片段，其重鏈和輕鏈的多樣性分別為70.59%和76.47%，重、輕鏈組合后其多樣性為94.12%，提示該基因文庫多樣性良好，可以滿足抗體庫篩選的要求。

下一步我們將在構建高質量的噬菌體抗體庫、篩選EV71病毒特異性抗體等方面展開進一步的研究，實現生產高親和力、高產量的人源化中和性EV71病毒單克隆抗體的目標。

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