豬鏈球菌2型中國強毒株05ZYH33 ofs基因敲除突變株構建及其生物學特性研究

李 敏，王 晶，史沛舉，郭靜靜，杜驍杰，李先富，王長軍，潘秀珍， ，高基民

豬鏈球菌2型(Streptococcussuis2，S.suis2)是一種危害全球的人獸共患病病原菌。該病原菌不僅可致豬腦膜炎、敗血癥、關節炎、肺炎及心內膜炎等，而且還可感染人,給相關從業者和廣大群眾的生命安全造成嚴重威脅[1-2]。但目前S.suis2致病的具體機制仍不清楚。對于豬鏈球菌毒力因子的研究一直是一個熱點，目前只有莢膜多糖(CPS)是唯一證明的主要毒力因子[3]。其它已知的與S．suis致病性相關的毒力因子有溶菌酶釋放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)，二肽酶Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase IV)、烯醇化酶(Enolase)以及豬鏈球菌組氨酸三聚體蛋白(Histidine triad protein ofS.suis，Htps)等[4-9]。S.suis2的不同分離株致病性具有很大差異，可能與其毒力因子密切相關。豬鏈球菌血清渾濁因子(Opacity factor ofS.suis，OFS)是豬鏈球菌中新近鑒定的的一種重要的毒力因子[10]。本課題組前期通過對中國強毒株05ZYH33進行生物信息學分析，證實基因組中存在ofs編碼基因(05SSU1663)，該基因位于基因組1575793-1578639 bp之間(基因全長2 847 bp)，并且對該基因的N-末端功能區域ofs37 - 683進行了敲除[11]。在此基礎上,為了進一步研究ofs在S.suis2致病過程中的作用，我們以強致病株S.suis05ZYH33為研究對象,利用同源重組的基因敲除原理構建了ofs基因全長敲除突變株, 并通過豬鏈球菌2型感染BALB/c小鼠模型實驗證實豬鏈球菌血清渾濁因子ofs基因全長缺失株對細菌毒力的影響，為進一步探究S.suis2新的致病因子及其致病機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、質粒和引物 文中所用菌株和質粒以及引物見表1和表2。

表1 實驗所用的菌株、質粒

表2 實驗所用引物序列

1.1.2主要試劑和儀器 ExTaq DNA聚合酶、DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、質粒DNA抽提試劑盒均為Takara公司產品；膠回收試劑盒為Promega公司產品，Todd-Hewitt Broth(THB)培養基為Difco公司產品；Gene Pulser XcellTM型電穿孔儀為Bio-Rad公司產品；Biodyne?B 正電荷尼龍膜(8 cm×12 cm)、CL-XPosureTM X 光膠片(5′×7′)、North2South?DNA 隨機引物生物素標記試劑盒、North2South?化學發光雜交檢測試劑盒為Pierce公司產品； parafilm 膜和WB506 型雜交袋為上海西唐生物科技有限公司產品；Whatman 3MM 濾紙為Whatman公司產品；顯影粉和定影粉為江蘇廣達攝影材料廠產品；核酸雜交儀為HYBAID公司產品；Ultrospec2000型紫外分光光度計為Pharmacia公司產品。

1.1.3實驗動物 BALB/c小鼠( SPF 級) ，雌性，4周齡，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.205ZYH33ofs基因敲除突變株的構建和鑒定

1.2.1基因敲除載體的構建 以S.suis2 05ZYH33基因組DNA為模板，用引物對LA1 /2、RA1 /2分別擴增ofs基因的上下游DNA片段LA及RA; 同時以pSET2質粒為模版，用引物Spc1/2擴增壯觀霉素抗性基因(spcrcassette)。分別將LA、RA片段連接到 pMD-18T上，將Spc片段到pUC18上。在限制性內切酶EcoR I和BamH I及T4DNA連接酶的作用下，將LA連接到pUC18-spc上，再利用限制性內切酶SalI和SphI及T4DNA連接酶將RA連接到pUC18-LA-spc上，形成一個spcr基因兩側具有與ofs上下游同源序列同源的基因敲除載體pUC18-LSR(圖1)，并通過雙酶切和測序對其驗證。

圖1 ofs基因敲除載體構建示意圖

1.2.2基因敲除突變株的構建和和鑒定 參照Smith等[12]的方法制備S．suis2 05ZYH33感受態細菌。在22.5 Kv/cm、500 Ω和25 μF電轉參數下，將基因敲除載體pUC18-LSR電轉化入感受態細菌，電轉結束后將菌液涂布于THB平板(含100 mg/mL壯觀霉素)，37 ℃培養48 h后，挑取單菌落進行培養并取2 μL菌液作模板，用引物對IN1/IN2 (位于ofs基因的內部)進行PCR初步篩選，并對疑似陽性菌株進行組合PCR和Southern雜交驗證。

1.3生物學特性分析

1.3.1革蘭氏染色分析 分別將突變株和野生型接種THB 培養基(含10%胎牛血清)中于37 ℃培養至OD600≈0.6, 用接種環取樣均勻涂布于載玻片上, 自然晾干后進行常規革蘭氏染色,于油鏡( 1000 倍)下觀察菌落形態。

1.3.2菌落形態和溶血活性的比較 將突變株△ofs和野生株 05ZYH33 用三線法分別劃線接種于 THB瓊脂血平板(5%綿羊血)， 37 ℃培養48 h后，觀察突變株和野生株在菌落形態和溶血活性方面的差異。

1.3.3細菌生長速率的比較 取等量(OD600≈0. 008)的突變株和野生株菌液37 ℃振蕩培養，每間隔1 h測取OD600值，直至細菌生長處于穩定期，重復實驗3次并繪制生長曲線。

1.3.4小鼠致病性實驗 參照本實驗室常規的方法進行[13-15]。30只BALB/c小鼠隨機分為3組，每組10只。將野生株05ZYH33和突變株Δofs于37 ℃過夜培養12 h，次日以1∶100的比例接種于新鮮配制THB中生長至OD600≈0.4，分別經腹腔接種野生株05ZYH33與敲除株Δofs菌液各1 mL (1×108CFU / 只)，陰性對照組注射THB培養基1 mL，及時觀察記錄小鼠發病及死亡情況。

2 結 果

2.105ZYH33ofs基因敲除載體的驗證 對構建好的重組質粒進行PCR(圖2)和雙酶切驗證(圖3), 結果與預期一致。對重組質粒的測序結果也顯示3個片段LA(1 024 bp)、Spc(1 130 bp)和RA(989 bp)連接測序正確，重組質粒構建成功。

2.205ZYH33ofs基因敲除突變株的初步篩選 用引物對IN1/IN2對挑取的單菌落進行PCR。由于引物對IN1/IN2位于ofs基因內部(產物大小為915 bp)，如果ofs基因被Spc抗性基因所置換，那么PCR擴增會得到陰性結果，反之則說明ofs基因未被敲掉。通過這種方法進行初步篩選。在一組菌液PCR擴增中，IN1/IN2引物擴增結果(圖4)中3泳道為陰性，選擇該株做進一步驗證。

圖2PCR擴增產物凝膠電泳

Fig.2GelelectrophoresisofPCRproduct

1: 1 kb DNA ladder marker; 2: PCR products with LA1/LA2; 3: PCR products with Spc1/Spc2; 4: PCR products with RA1/RA2; 5: PCR products with LA1/Spc2; 6: PCR products with Spc1/RA2; 7: PCR products with LA1/RA2.

圖3pUC18-LSR雙酶切鑒定

Fig.3RestrictionenzymedigestionoftherecombinantplasmidpUC18-LSR

1: 1 kb DNA ladder; 2: Digested byEcoR I andBamH I; 3: Digested byBamH I andSalI; 4: Digested bySalI andSphI; 5: Digested byEcoR I andSalI; 6: Digested byBamH I andSphI; 7: Digested byEcoR I andSphI.

圖4PCR鑒定

Fig.4PCRanalysis

1: 1 kb DNA ladder marker; 2-9: Mutant strains; 10: Positive control (DNA of 05ZYH33);11: Negative control (sterile water).

2.305ZYH33ofs基因敲除突變株的組合PCR鑒定 根據05ZYH33 基因組DNA序列，分別于ofs編碼基因上下游的外側設計兩條引物OUT1(位于LA上游)和OUT2(位于RA下游)，引物位置如圖5A所示。ofs基因敲除突變株用引物對OUT1/Spc2、Spc1/OUT2和Spc1/2經PCR擴出大小分別為2 225 bp、2 246 bp和1 130 bp的片段，而在野生菌株05ZYH33中則未見相應片段，以野生株05ZYH33基因組為模版，用引物IN1/IN2能擴出的915 bp的片段，在突變株中未能擴出相應片段。組合PCR的結果(圖5B)與以上理論完全一致。同時，用引物對OUT-1 /OUT-2 擴增的PCR 產物(圖5C)進行克隆和測序，測序結果亦證明所獲得的菌株已經成功發生雙向同源重組。

圖5組合PCR鑒定

Fig.5Multiple-PCRanalysis

A: Primers design;

B: IN1/IN2: 1--05ZYH33, 2--Δofs; Spc1/Spc2:

3--05ZYH33, 4--Δofs; OUT1/Spc2: 5--05ZYH33,

6--Δofs; Spc1/OUT2: 7--05ZYH33, 8--Δofs;

C: OUT-1 /OUT-2: 1--05ZYH33, 2--Δofs.

2.405ZYH33ofs基因敲除突變株的Southern鑒定 通過Southern雜交對Δofs基因組上的突變基因進行定位分析。使用ofs基因中間片段(引物IN1/IN2的PCR產物)作為標記探針，用隨機引物法進行生物素標記，參照試劑盒說明書進行操作。雜交結果如圖 6B所示，基因敲除載體pUC18-LSR 與細菌的染色體重組后可能出現3種情況(如圖6A所示)，3種情況下雜交帶的大小有所不同。在野生株05ZYH33基因組酶切產物中，出現了一條約4.5 kb的ScaI單酶切片段,與預計酶切片段4.5 kb(等位基因置換)大小相符(圖6B，泳道1)，而在突變株中未出現條帶(圖6B，泳道2)，說明SpcR基因已經通過雙交換同源重組置換了ofs編碼基因(圖6A-I)。在mutant1基因組酶切產物中，出現了一條大約7.2 kb的ofs探針雜交帶，說明mutant1只是發生了5′端同源序列單交換的突變株(圖 6B，泳道 3)。結果充分證實ofs基因在基因水平已被成功敲除。

Fig圖6A同源重組示意圖

FigFig.6AHomologousrecombinationschematicdiagram

Ⅰ: Double cross-over; Ⅱ: 5′ single cross-over; Ⅲ: 3′ single cross-over.

圖6B突變株Δofs的Southern雜交分析

Fig.6BSouthernhybridizationanalysisofmutantΔofs

1: 05ZYH33 genome/ScaI; 2: Δofsgenome/ScaI; 3: Mutant1 genome/ScaI.

2.5革蘭氏染色分析 取生長至OD600≈0.6的突變株△ofs和野毒株05ZYH33進行革蘭染色，顯微鏡下觀察發現(圖7)，二者均為典型的革蘭陽性菌，菌體形態為圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，呈短鏈狀排列，無明顯差異。

圖7 革蘭氏染色分析

2.6菌落形態和溶血活性的比較 將野生株05ZYH33和突變株△ofs接種于羊血THB 平板并于37℃孵育48 h 后，可見二者均長出灰白色、圓形半透明、濕潤、表面光滑的細小菌落(直徑為1～2 mm)，菌落周圍有明顯的β-溶血環 (圖8)。表明與野生株相比，突變株的菌落形態和溶血活性沒有發生明顯的變化。

圖8 溶血活性分析

2.7細菌生長特性比較 在相同的培養條件下繪制野生株與突變株的的生長曲線(圖9),從圖中可以看出，突變株和野生株的生長速率相近，于接種后3 h左右進入對數生長期，約在培養10 h后進入平臺期，并無顯著差別。

圖9 生長特性比較

2.8小鼠致病性實驗 觀察結果顯示，攻毒16 h后野生株注射組死亡9只，突變株死亡5只。24 h后野生株注射組小鼠全部死亡，突變株4只存活。36 h后突變株3只存活。陰性對照組10只狀態均良好。持續觀察3 d，未見發病和異常情況發生。用Kaplan-Meier生存函數分析方法比較突變株與野生組小鼠的存活率，并繪制生存曲線(圖10)，P<0.05，說明ofs基因敲除使得05ZYH33的毒力減弱。

圖10小鼠生存曲線

Fig.10SurvivalcurvesforBABL/cmiceinfectionexperiments

3 討 論

豬鏈球菌血清渾濁因子OFS是新近鑒定的豬鏈球菌中的一種毒力因子。Baums等[10]研究表明OFS具有革蘭氏陽性細菌表面蛋白的典型特征：N-末端的信號肽，大的N-末端區域，重復序列和C-末端的LPXTG錨定位點。本研究前期通過生物信息學分析發現，S.suis2 05ZYH33 中存在ofs編碼基因[11]。通過比較OFS與S.pyogenes的SOF及S.dysgalactiae的FnBA的序列，發現OFS與SOF及FnBA在序列上有同源性，推測它們在功能上也有相似性。它們屬于一類稱作微生物表面識別粘附基質分子的組分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMs)的細菌表面配基。廣泛存在于哺乳動物的組織液、基質或細胞的外表面，是化膿性鏈球菌、停乳鏈球菌黏附和定植到宿主細胞表面的主要介質，因此這些蛋白是鏈球菌入侵的重要毒力因子[16]。

在S.pyogenes中通過插入失活構建的sof突變株對小鼠的致病能力降低，在人全血中的存活率也降低[17]。用重組的SOF能夠起到免疫保護作用，揭示SOF是一種重要的毒力因子[18]。以豬為模型的動物實驗也證實ofs的缺失導致2型豬鏈球菌毒力的降低[10]。對于豬鏈球菌毒力因子的研究一直是熱點，莢膜多糖CPS為S.suis2 中目前唯一明確的毒力因子。然而并不是所有有莢膜的2型豬鏈球菌菌株都有致病性。不同的菌株間毒力上存在著差異[19-20]。

實驗室前期基于基因敲除技術，致力于探索研究新的致病相關基因的功能及其在S.suis與宿主相互作用中發揮的作用，構建了多個S.suis2毒力相關因子突變株，對它們的致病力強弱及致病機制進行了相關研究，為深入探討豬鏈球菌2型致病機制積累了豐富的數據資料。本研究根據同源重組原理構建了中國強毒株05ZYH33ofs基因全長敲除突變株，并通過組合PCR、Southern雜交和DNA測序對敲除突變株進行了鑒定。通過一些生物學特性比較顯示, Δofs基因突變株和野生株05ZYH33在成鏈形態及鏈長短、溶血活性、生長特性方面均無明顯差異。小鼠毒力實驗表明ofs基因缺失株的毒力較野生株明顯降低，與前述報道的結果相似。由此可見，OFS是中國強毒株05ZYH33的一個潛在毒力因子。在此基礎上我們還將進一步研究△ofs突變株與野生株在粘附和抗細胞吞噬方面的差異，以期闡明ofs基因在豬鏈球菌2型05ZYH33強致病過程中的作用機制。

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