抗菌肽HBD基因工程表達的研究近況

萬 健，吳三橋，趙冠杰，陳 琛

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs) 是生物體特定基因編碼產生的一類小分子多肽，具有抵抗外界微生物侵害的作用，是生物天然免疫系統中的一個重要組成部分，與傳統抗生素相比，抗菌肽具有分子量小、熱穩定好、水溶性好、強堿性、廣譜抗菌和作用機制獨特等特點[1-4]。20世紀80年代瑞典科學家HG.Boman等從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離出第一個抗菌肽—天蠶素(cecropin)[5]。此后，人們相繼從細菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發現了2000多種抗菌肽?？咕目梢愿鶕陨蟻碓捶诸?，也可以根據結構將其分為5種：(1)α-螺旋結構抗菌肽，如Cecropin A、Magainin；(2)β-折疊肽，如Tachyplesins；(3)富含半胱氨酸的抗菌肽，如HNP-1，-2和-3；(4) 富含特殊氨基酸的抗菌肽，該類型抗菌肽通常帶有一個或多個占主導地位的氨基酸， 如從牛的嗜中性細胞里分離出來的Indolicidin 由13個氨基酸殘基組成， 其中就含有5個色氨酸；(5)含稀有被修飾氨基酸的抗菌肽。人抗菌肽分為三類：防御素(defensins)、cathelicidins和富組蛋白(histatins)。

防御素是廣泛存在于動植物體內的一類具有抵抗外界微生物侵襲的堿性陽離子抗菌肽。人防御素根據其一級結構及所含3對二硫鍵連接方式的不同可分為α-防御素(human α-defensin, or human defensin neutrophil peptide,HNP )和β-防御素。α-防御素的3對二硫鍵以1-6，2-4，3-5的方式連接，β-防御素的3對二硫鍵以1-5，2-4，3-6的方式連接(如表1)，它們具有相似的3條反向平行β-片層結構。Bensch等[6]于1995年首次從腎功能衰竭病人的血液透析液中分離出HBD-1并獲得其氨基酸序列，隨后其他5個 HBD被相繼發現，目前人β-防御素家族有6個主要成員，HBD-1～6。β-防御素主要表達于哺乳動物皮膚和粘膜上皮細胞，是機體抵御外界微生物侵害和參與免疫應答的重要成員，具有極強的抗菌[7]、抗病毒[8-9]、抗腫瘤活性[10]以及免疫學活性[11-13]。本文對HBD的結構、表達部位，原核、真核表達的系統，表達技術和方法進行了綜述，以期對人β-防御素及其他抗菌肽的基因工程重組表達提供思路。

1 HBD的結構及表達部位

HBD基因定位于人染色體8p22～p23.1區小于1M的范圍內，由2個外顯子和1個內含子構成，HBD家族的六個主要成員均位于該區域內。HBD前體由93～95個氨基酸組成，包括信號肽、原片段和成熟肽3部分。在整個氨基酸序列中有2種高度保留的氨基酸，一種是位于N端的甘氨酸(2個)，另一種是半胱氨酸(6個)，保守的6個半胱氨酸殘基配對形成3對二硫鍵，起穩定結構的作用。二硫鍵和β-片層結構可以使小分子防御素緊密連結以抵抗蛋白酶水解，即使在富含蛋白的吞噬溶酶體環境中仍能保持其活性，這也是防御素不同于其他抗微生物肽的主要原因。

HBD-1由36個氨基酸組成，約7.0 kb，其第一個外顯子編碼信號肽和原片段，第二個外顯子編碼成熟肽，在上皮細胞中是生理性表達。HBD-2由41個氨基酸組成，其中第一個外顯子編碼5′端非翻譯區信號肽區和前導肽區，第二個外顯子編碼部分前導肽成熟肽和3′端非翻譯區，HBD-2的各種生物活性都是由成熟肽來執行完成。HBD-2主要表達在受感染刺激后的皮膚和黏膜組織中，是一種誘導型防御素，在感染、炎癥等狀態下表達明顯增強[14]，且研究人員發現NF-kB與這種誘導表達密切相關[15-16]。HBD-3主要表達于皮膚、口腔粘膜和扁桃體中，在呼吸道、生殖道上皮細胞和胎盤中亦有表達，可被TNF-a、IL-1β-、TGF、γ-干擾素等誘導表達。與HBD-1表達方式不同，HBD-2和HBD-3主要為誘導型表達。HBD-4在睪丸中高表達，在胃竇中也有較高表達，而在甲狀腺、肺、腎、子官和中性粒細胞中微表達。HBD-5和HBD-6僅在附睪細胞中有所表達。

表1 人β-防御素氨基酸序列、分子結構

2 HBD的基因工程重組及表達

由于抗生素的長期廣泛使用，使得許多細菌都產生了耐藥性，比較突出的有2010年新德里“超級細菌”事件[17]。與傳統抗菌藥物相比，人β-防御素熱穩定性好，高效廣譜抗菌，具有極強的抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫學活性[18]，病原菌對其不易產生耐藥性。HBD的這些優點決定其在醫藥衛生、畜牧業、食品工業等方面將發揮極為重要的作用。怎樣大量獲得HBD就成了首要問題，目前獲取的主要途徑有3條：從細胞或體液中提取、化學合成、基因工程表達。HBD在組織中的表達量極少，純化工藝的難度與成本也較高，化學合成價格昂貴，且體內蛋白質往往需要翻譯后的修飾才具有活性。因此，通過基因工程手段大量生產HBD成為一條非常有效的途徑。

2.1HBD的原核表達 在各種表達系統中，原核表達系統是最早采用的，也是目前掌握最為成熟的表達系統。大腸桿菌具有培養條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可高表達外源基因等優點，是目前HBD表達采用最多的表達系統。

由于人β-防御素是一類陽離子小分子多肽，表達過程中極易在蛋白酶的作用下降解，而且對宿主細胞有細胞毒性作用，易造成宿主細胞的死亡。通常HBD基因在大腸桿菌中采用融合型表達，即目的蛋白HBD與一段融合標簽序列如組氨酸標簽蛋白(His-Tag)、硫氧化還原蛋白 (Thioredoxin, Trx)、類彈性蛋白(Elastin-like peptide, ELP)、小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-related modifier, SUMO)等融合表達，這些融合標簽可增加HBD mRNA的穩定性，為進一步的蛋白分離、純化、檢測等提供便利，同時也可以有效的抑制宿主蛋白酶的降解活性，其作用類似于天然抗菌肽產生過程中能夠保護抗菌肽及宿主菌的前導肽部分[19]。HBD在大腸桿菌中的表達，國內外開展了大量的研究，具體見表2。

表2 人β-防御素在大腸桿菌中的表達

注：DHFR=運載蛋白 Intein=內含肽 ND= Not Determined

自Harder等[20]在原核細胞中采用了融合表達的方式，首次實現了HBD-3的體外表達以來，隨著對基因表達調控機制的深入研究，及其在生物技術領域的發展，原核表達系統在功能上得到了進一步的改善，HBD的原核表達經歷了一個從無到有，表達量由低到高，抗菌活性由弱到強，純化過程由復雜到簡便的歷程。

雖然HBD在大腸桿菌中表達有諸多優點，但大腸桿菌表達體系與其他體系相比也有一些缺點：高效表達但易形成包涵體，不能進行翻譯后的加工修飾，如糖基化、磷酸化、酰基化以及二硫鍵的形成等，而且E.coli表達的蛋白還會保留它們氨基末端的甲硫氨酸，這會影響到目的蛋白的穩定性，并產生免疫原性。最近有研究發現共表達折疊酶或者分子伴侶在一定程度上能克服包涵體的形成，分子伴侶本身不是功能蛋白的組成部分，但是能夠阻止分子間和分子內不正確的折疊，進而幫助蛋白質折疊成正確的構象。Li等[25]利用小分子泛素蛋白(SUMO)融合表達系統，在大腸桿菌中表達HBD4-SUMO融合蛋白，可以促進HBD4的正確折疊，增加表達量，而且融合蛋白經過SUMO酶酶切去除SUMO標簽后，N端沒有殘留氨基酸，得到純度較高的目的蛋白。

最近幾年，研究人員重點研究將目的蛋白與一些具有活性的小蛋白融合，進而促進目的蛋白在E.coil中的表達[27]，或者通過改造現有的表達載體，構建各種促溶標簽載體，進而使在E.coli中以包涵體形式表達的蛋白以可溶性形式表達[28]。

2.2HBD的真核表達 真核表達系統包括酵母表達系統、哺乳動物細胞表達系統、昆蟲表達系統等。酵母是一類低等真核生物，它既有類似原核生物的生長特性，又有一般真核生物基因表達調控機制及對表達產物的加工修飾和分泌能力，并且不會產生內毒素，是目前HBD表達應用最為普遍的真核表達系統之一。

2.2.1在酵母中表達 酵母表達系統中以畢赤酵母表達系統最為人熟知，具有操作簡單、高水平分泌表達外源蛋白、便于純化、利于大規模工業化生產等優點。畢赤酵母可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養基上生長，而且甲醇能夠誘導畢赤酵母合成大量的乙醇氧化酶(AOX1)。AOX1是強啟動子，能夠高水平誘導表達外源基因。酵母帶有α分泌信號，可引導外源蛋白的分泌，減輕宿主細胞的代謝負荷以及宿主細胞蛋白水解酶的降解作用。近年來研究者開展了HBD在酵母中的表達，具體見表3。

表3 人β-防御素在酵母中的表達

雖然HBD在畢赤酵母中表達相對于在大腸桿菌表達起步比較晚，但畢赤酵母表達系統具有其他表達系統所無法比擬的優點: 如對營養要求低，易于高密度發酵，自身分泌的背景蛋白少，因酵母是真核生物，安全性高，提供翻譯后加工和分泌的環境，不會形成包涵體，易于進行分離提純等，使得人β-防御素在畢赤酵母中表達的研究有很大的優勢。

盡管如此，HBD在畢赤酵母中表達也存在著一些問題，比如畢赤酵母的糖基化程度比哺乳動物偏大，而且糖基化途徑與人不同，從而影響了HBD蛋白的結構和功能。過去的20多年里，有很多研究人員致力于畢赤酵母的N-糖基化改造過程中。王越等[34]成功構建了敲除α-1, 6-甘露糖轉移酶基因的巴斯德畢赤酵母，和野生型相比，大大降低了蛋白質的糖基化程度，從而為酵母的糖基化工程提供了基礎。另外，信號肽加工不完全以及內部降解等造成表達產物不均一，這在一定程度上限制了畢赤酵母的應用。酵母表面展示技術，利用酵母細胞壁蛋白(α-凝集素)與外源蛋白相融合，融合蛋白表達分泌中由于其糖基化蛋白與細胞壁的共價結合作用，將外源蛋白錨定在細胞壁上[35]。提示，也許以后HBD的表達也能應用這項技術，這樣可以減少純化工藝，提高回收率。

2.2.2在哺乳動物細胞中表達 HBD在哺乳動物細胞中表達也有報道，彭巍等[36]將HBD-3 cDNA插入到真核表達載體pEGFP-C1 中，構建乳腺特異性表達載體pEBCD，脂質體介導法轉染奶牛胎兒成纖維細胞G418，之后檢測到重組HBD-3蛋白可以在奶牛乳腺上皮細胞組織特異性表達。王慧等[37]構建HBD-2真核表達重組質粒pcDNA3.1-zeo(+)-HBD-2，經脂質體介導轉染293細胞，RT-PCR檢測到HBD-2基因成功轉染293細胞，表達的HBD-2有較強的抗金黃色葡萄球菌活性。曹玉紅等分別將重組真核表達載體pcDNA3.1+/HBD4和pEGFP-N2/HBD4導入COS-7和HEK293細胞，均檢測到了HBD4蛋白的表達，并具有較強的殺菌作用[38-39]。

與其它真核細胞表達系統相比，HBD目的基因在哺乳動物細胞中表達與天然的結構、糖基化類型和方式幾乎完全相同，并且在蛋白合成起始信號、加工、分泌等方面具有獨特優勢。但是哺乳動物表達系統成本相對較高，技術復雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染[40]。

3 展 望

人β-防御素因具有廣譜的抗菌活性，在抵御病原微生物的侵襲、參與免疫反應中發揮著重要的作用，且病原菌對其不易產生耐藥性，因此它們有望成為一類新型的抗菌藥物，從而解決細菌的耐藥性和抗菌素的毒副作用等問題。通過基因工程技術制備HBD的研究，將會為今后制備類似藥物奠定基礎，指導抗微生物肽類藥物設計和開發，為其提供理想的分子設計骨架和模板。新型、高效、低毒、廣譜的HBD將會在醫藥衛生、農業、食品、飼料添加劑、動植物抗病轉基因等領域發揮出重要的作用，對人類的健康和生活產生深遠的影響。

表4 各種表達系統比較

表4對HBD基因工程重組表達系統進行了比較，HBD在大腸桿菌中雖能高效表達但易形成包涵體，且后期分離純化過程比較繁瑣，表達后還需要活化才有生物活性；哺乳動物表達系統成本相對較高，技術復雜，表達過程中存在著潛在的動物病毒的污染；畢赤酵母表達系統因操作簡單、高水平分泌表達外源蛋白、便于純化、利于大規模工業化生產，表達產物HBD有較好的抑菌活性等優點。隨著對基因表達調控機制的深入研究及其在生物技術領域的發展，所有的表達系統都可以在功能上有進一步的改善。但是，一些表達系統本身固有的缺陷也不能忽略，因此在選擇HBD表達系統時應綜合考慮表達水平、表達周期、安全性、蛋白質性質等因素。

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