大伏革菌防治針葉樹根腐病的研究進展

李杏春 何雙輝

（北京林業大學微生物研究所，北京 100083）

針葉樹根腐病是北溫帶地區普遍分布的一種重要病害，在亞熱帶地區僅局部分布，危害較小。根據植物病害分布地圖［1]，該病害在美國、加拿大、法國、德國、印度及日本等全球40多個國家均有分布。據調查，該病害在我國東北林區甚為常見，在四川省西部和云南省西北部高山針葉林區內也比較普遍，在云南鐵杉、黃櫟林內有時也能見到［2-4]。該病害常導致針葉樹幼林內大量林木死亡，在成年林或過熟林內，根白腐常導致干基腐朽，嚴重影響經濟用材的出材率；而且由于根腐病常引起根部死亡，導致林木生長量的降低，其在經濟上的損失更大。

針葉樹根腐病的病原菌是異擔子菌Heterobasidion，能引起針葉樹根腐病的異擔子菌有5個生物種，分別是狹義多年異擔子菌H. annosum（Fr.）Bref. senso stricto、小孔異擔子菌H. parviporumNiemela &Korhonen、冷杉異擔子菌H. abietienumNiemela &Korhonen、異孔異擔子菌H. irregulareGarbelotto &Otrosina和西方異擔子菌H. occidentaleOtrosina &Garbelotto。造成我國針葉樹根腐病的病原菌并非真正的多年異擔子菌，而是小孔異擔子菌，是從異擔子菌復合種中分離出的一個獨立的種［5，6]。但是，隨著國內對原木需求的不斷增長，國外云杉、冷杉等針葉樹進境較多，多年異擔子菌、冷杉異擔子菌、異孔異擔子菌和西方異擔子菌隨進口原木傳入、擴散、定殖的風險很大［7-8]，所以，我們仍然需要防患于未然，提前做好相應的準備工作。

該病害自1800年發現到現在，很多國家對其病原菌、致病機制、防治方法及各種防治方法的生態影響都進行了深入的研究。截至目前，主要防治方法有營林措施防治、化學防治和生物防治［9-11]。營林措施防治主要指造林和樹樁移除；化學防治的主要試劑有尿素、硼砂、氯氧化銅、雜酚油等［12-14]；生物防治的主要真菌有大伏革菌Phlebiopsis gigantea、紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola（Sw.）P. Karst.、黑管孔菌Bjerkandera adusta（Willd.）P. Karst.和哈次木霉Trichodermaspp.等［9，15，16]。但是，實踐的結果表明大伏革菌和哈次木霉的防治效果較好［14，17-21]，且目前已研制出大伏革菌的商品化制劑。在這3種防治方法中，營林措施防治較費時費力，成本較高；化學防治方法短期內較有效，但大量使用化學物質進行防治，不利于生態環境的可持續健康發展；而生物防治方法效果很好，它不僅能夠控制已發病的樹木，還能有效地控制周圍樹木的感染，而且對周圍生態環境的影響是最小的，是防治該病害最長遠和有效的方法。本研究著重介紹目前生物防治異擔子菌使用最多且效果最好的大伏革菌在國際上的研究現狀以及國內的研究進展。

1 大伏革菌介紹

大伏革菌隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、原毛平革菌科（Phanerochaetaceae），是一種常見的木材腐朽菌。在自然環境中，大伏革菌子實體通常生長在樹樁和倒木上，其生長對濕度的要求較高。一般情況下，被侵染樹樁在1年后開始出現子實體，3-4年后子實體成熟［22]。成熟的子實體開始產生擔孢子，擔孢子是侵染樹木的主要形態，它能夠被廣泛的傳播，在距離產孢中心250 m遠的地方均有擔孢子出現。擔孢子大多在晚上釋放，影響其形成速率的主要因素有溫度和空氣濕度等。另外，大伏革菌經過菌絲斷裂過程可以產生無性孢子，無性孢子也可以侵染樹樁，但到目前為止，關于無性孢子傳播方式的研究較少。

大伏革菌菌株有同核體和異核體之分，同核體是指在菌絲體中細胞核的基因型相同，它是由基因型相同的菌絲融合而成；異核體是指帶有不同遺傳性狀的兩個單倍體菌絲相互融合，導致菌絲體中并存有兩種或以上不同遺傳型的核。大伏革菌同核體和異核體菌株之間在形態上無明顯區別，但在性質上有較大差異，特別是在防治病原菌方面，同核體菌株的孢子產量比異核體菌株大得多，但只能在室內實驗室條件下防治異擔子菌，其生長速率和防治效率均比異核體菌株小，在林地中易退化［23，24]，故在防治異擔子菌中沒有實際應用價值。因此，目前無論進行室內研究還是生產商業制劑均采用異核體菌株。

2 大伏革菌防病歷史及商業化菌劑發展

1950年，英國人Rishbeth［20]首先提出用大伏革菌防治異擔子菌，大伏革菌可以像異擔子菌一樣侵染樹木活組織，通過優先占領生態位來控制異擔子菌在該樹樁上的生長，其侵染過程不依靠其他微生物的輔助作用。大伏革菌在自然狀態下侵染松樹的概率很高，這樣可以保護松樹免受異擔子菌侵染。在英國，大伏革菌侵染樹樁概率和侵染面積均比異擔子菌高，但兩者侵染樹樁的季節不一樣，大伏革菌孢子對于干燥的環境更敏感，在溫暖且極其干燥的情況下，大伏革菌產孢率降低，與異擔子菌間競爭減弱，導致異擔子菌大范圍侵染樹樁。在芬蘭，大伏革菌和異擔子菌孢子出現的時間大致相同，在5月末到8月末大伏革菌孢子出現概率最大，此時可以顯著降低異擔子菌的侵染率。Meredith［25]通過試驗證明，大伏革菌孢子即使比異擔子菌孢子沉降低，也可以降低異擔子菌侵染面積。

最初應用大伏革菌作為生防劑時，在接種量和應用劑型方面還難以把握。1963年，Rishbeth［22]制作了片狀的生防劑，用以溶解稀釋后噴灑于伐樁表面。試驗得出在20℃條件下，溶解稀釋后的孢子懸浮液在48 h后孢子活力沒有顯著降低，但實際應用中建議現用現配。此劑型主要缺點是在森林中使用時至少要提前1 h水化，實際常常需要通宵浸泡。1968年，Rishbeth優化了生防劑型，以乳化油替代了片劑應用于森林中［9]，但乳化油較易污染，很難維持無菌狀態。1970年，產品被重新包裝，新的包裝形式是將孢子懸浮液混合于蔗糖溶液中，將此混合物密封于聚氯乙烯小袋中，此商品克服了過去出現的問題，且保存時間長。因此，英國人將該混合物發展為商業化菌劑，商品注冊名為“PGS”［26]。PGS只能施用于松樹上，在4℃條件下保存7個月。此后，多個國家（如保加利亞、加拿大、芬蘭、法國、德國和波蘭等）將此商品應用于林地進行野外防治，取得了較好效果。

與此同時，各國科學家們都在研究適合自己國家的生物防治菌劑。1970年，波蘭商業化的生防菌劑產生，注冊名為“IBL”。此商品是將大伏革菌的孢子和菌絲接種于滅菌后的山毛櫸木屑中，將此混合物放于聚乙烯的小袋中，可應用于松樹和云杉上，在干燥低溫環境下可存放1年。1991年，芬蘭科學家從云杉樹樁上分離得到一株異核體大伏革菌，將其做成可濕性粉劑，混合硅膠后，密閉封存在箔襯袋中，此商品注冊名為“Rotstop”，其可應用于松樹和云杉上，在零下18℃條件下可存放18個月；8℃下存放1年；室溫下可存放1星期。但打開包裝后必須在24 h內使用［26]。與此同時，美國也生產了大伏革菌商品化制劑，但是未獲得認可。在Fennoscandia地區，每年有62 000 hm2的歐洲云杉使用大伏革菌來防治異擔子菌；在整個歐洲，每年有超過20萬棵樹木使用此方法來進行根腐病的防治［27，28]。

中國對針葉樹干基腐朽病的防治研究較少。作者于2012年在中國東北林區及云南省廣泛采集和分離野生大伏革菌，并且通過室內培養基及木樁實驗，對比了我國的和國外引進的野生大伏革菌對中國小孔異擔子菌的防治效率。實驗結果表明，中國大伏革菌防治小孔異擔子菌的效率較國外大伏革菌差。

3 大伏革菌防病機制

早期研究表明，大伏革菌抗異擔子菌的機制可能有3種：菌絲干涉、營養競爭和誘導寄主抗性。

3.1 菌絲干涉

菌絲干涉是在真菌競爭間普遍存在的一種現象，大伏革菌能夠引起異擔子菌菌絲結構及功能變化，在一定程度上造成異擔子菌死亡。它們之間的菌絲干涉模式和Ascobolus crenulatus與Coprinus heptemerus之間干涉模式相似，即在兩者接觸區域，質膜內陷，形成超大的質膜囊泡，細胞里的內含物通過此囊泡外泄，細胞逐漸瓦解、死亡，而且在兩者接觸區域無可見的線粒體，連結線粒體的電子致密物質沉積［29，30]。Mgbeahuruike等［31]在2013年指出，大伏革菌培養過程中分泌的微小粒子能夠抑制異擔子菌早期葡萄糖代謝過程的關鍵酶表達。同時，由于大伏革菌的干涉作用，兩種菌絲交互作用中異擔子菌編碼信號轉導過程中的關鍵蛋白的基因表達水平降低，使其競爭力減弱。

3.2 營養競爭

大伏革菌作為營養競爭者，通常和病原菌之間競爭碳、氮和鐵等營養元素，進而限制其增長，營養競爭的關鍵在于其能夠快速的在樹樁上定殖，占領更多的生態位，致使異擔子菌不能夠繼續侵染樹樁。K??rik和Rennerfelt［32]在1957年證實大伏革菌比異擔子菌能更快的侵染樹樁，也能在已被病原菌侵染的樹樁上代替異擔子菌。這和大伏革菌胞外酶的分泌有必然聯系，因為大伏革菌作為一種常見的木材腐朽菌，能夠產生許多胞外酶，這些酶可以降解木材組織，利用降解產物來滿足自身對于營養物質的需求，同時達到定殖于樹木上的目的。一般情況下，不同大伏革菌菌株產生某種酶的酶活性不一樣，酶活越高，定殖樹木的速率就越大，生物防治的潛能也就越大。大伏革菌產生的胞外酶有：脫氫酶、磷酸酶、纖維素酶、漆酶和通用過氧化物酶等。Anna等［33]在2008年指出，大伏革菌產生的漆酶較少，過氧物酶、纖維素酶、磷酸酶和脫氫酶含量高。漆酶主要參與木質素氧化和殺菌的酚類物質降解和脫毒過程，大伏革菌缺少漆酶就說明大伏革菌不是致病菌。另外，大伏革菌產生P2O酶，該酶參與到木質纖維素的氧化解聚中，主要作用方式是給過氧化物酶（木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶）提供H2O2［34]。一般情況下，呼吸酶的活性（如脫氫酶和磷酸酶）可以作為真菌降解過程強弱的量度，磷酸酶的活性受脫氫酶的影響。2000年，Varela和Martinez［35]在大伏革菌中發現木質素過氧化物酶，大伏革菌高的過氧化物酶活性象征著樹木木質素生物降解的開始，這對于白腐菌是必要的過程。

3.3 誘導寄主抗性

施用大伏革菌能使寄主細胞產生有毒的代謝物質，這些代謝物質限制了異擔子菌進一步生長。在植物生命活動中，細胞程序化死亡對于植物正常生理活動是很重要的，而在這一過程中半胱氨酸起著重要的調解作用。研究發現，預處理大伏革菌后，調節半胱氨酸蛋白酶產生及壞死細胞死亡的基因高度轉錄［36，37]，寄主部分細胞程序化死亡，從而使由異擔子菌侵染引起的寄主組織壞死斑停止繼續擴展［38]。最重要的是，施用腐生營養型大伏革菌后能夠提高寄主的局部抗性，使寄主細胞壁木質化和栓化，強度增加，阻止了異擔子菌的侵染定殖。在大伏革菌預處理過的組織中，DAHPS和SAMS兩個基因高度轉錄，DAHPS基因可產生合成木質素過程中第一個酶［39]，而SAMA基因則編碼不同木質素衍生物合成過程中的關鍵酶［40]。木質素及其衍生物的合成，能夠阻止病原菌產生的酶和毒素的滲透和擴散，從而保護樹木組織。因此，這兩個基因的高度轉錄說明了它們在阻止異擔子菌侵入的過程中的起著關鍵作用。

4 大伏革菌防病過程對周圍環境的生態影響

在森林生態系統中，根際周圍存在著很多生物，如細菌、菌根真菌和昆蟲等，這些生物中有的能起到保護樹木的作用，它們通過營養競爭等手段來對抗木材腐朽菌。細菌在整個樹木腐朽過程中非常重要，如固氮細菌對腐朽過程中氮平衡的維持起到重要作用［41]。與化學防治相比，生物防治是一種環境友好的防治方法，其對靶標生物影響較小。然而，大規模的應用生物防治劑會不可避免地對針葉樹樹樁上的真菌、細菌群落及地表植被造成很大的影響［42-46]。

使用Rotstop處理初期，大伏革菌在樹樁上占主導地位，這并不影響其他微生物定殖樹樁。但是，由于大伏革菌生長速率較快，限制了其他微生物的營養利用，以致可減少達15%的物種豐富度。處理6年后，大伏革菌漸漸失去主導地位，而Resinicium bicolor、Hypholoma capnoides和Sistotrema brinkmannii等真菌逐漸增多［46]。在意大利，施用大伏革菌2年就會對該地區真菌區系造成很大影響［47]。另外，有研究表明大伏革菌的生長能夠顯著降低腐朽初期階段細菌的豐富度［43]。而應用單一基因型的Rotstop生物制劑在短時間內不會對當地大伏革菌種群基因型造成威脅［48]。

5 野生大伏革菌篩選過程、指標及防病注意事項

商業化生物制劑所用菌株均是從野外采集、分離，純化，最后通過一定的試驗驗證而得到的防治效果最好的菌株。Rotstop制劑所用菌株是同一種異核體菌株，PGS所用菌株是從野外采集選取的近10種菌株，而IBL選取的菌株則更多。這3種商業化制劑選取的野生大伏革菌菌株均是從野外的腐朽樹樁、原木或裸露的木片上采集和分離的。采集工作是一個持續的過程，我們必須不斷更新和補充菌株，篩選效果最好的菌株來防治異擔子菌。篩選可用于商業化的高效大伏革菌沒有固定的程序，總體來說分為3個方面。（1）在MEA培養基上測量大伏革菌生長速率和拮抗異擔子菌效率。實際工作中，IBL在MEA中添加了愈創木酚，測量其酚氧化酶活性；Rotstop在MEA中添加了木質素染料，測量其分解木質素的活性，這些對于篩選高效菌株都是必需的。（2）室內測量木樁上大伏革菌防治異擔子菌效率。其中，IBL選擇測量被異擔子菌侵染后木片失重率和預處理大伏革菌然后接種異擔子菌木片失重率，失重率測量同樣適用于室內木樁篩選生防菌。（3）在野外伐樁上測量前面篩選過的高效大伏革菌防治異擔子菌效率。PGS和IBL在松樹上進行，Rotstop在云杉上進行，經過野外伐樁防治效率的檢驗，最終確定商品化的菌株。2011年，Anthony［23]改良了室內篩選菌株的培養基，他所用的木鋸屑改良培養基是和自然介質最接近且最適合大伏革菌生長的培養基，可以用于快速篩選高生長率和拮抗作用的大伏革菌，而室內樹樁篩選關鍵看其在樹木上的生長速率。他在2012年指出，大伏革菌的兩個疏水蛋白Pgh1和Pgh2在其防治異擔子菌中發揮重要作用，強拮抗作用菌株在木鋸屑培養基的單菌落中Pgh1高度表達，拮抗能力和兩菌株接觸時Pgh1、Pgh2的轉錄水平呈正相關［49]。所以，在篩選高效菌株時，也可以從基因水平入手，這樣使結果更為準確。作者在前人研究的基礎上，從別人很少研究的酶活角度入手，研究大伏革菌纖維素酶活力與其木樁拮抗率的關系，試驗得出，兩者在0.01水平上顯著相關。纖維素酶能夠降解新鮮樹樁及其根部組織細胞壁纖維素結構，使真菌能夠快速定殖于樹樁，這是高效生防菌株所必須的，故作者認為可以將大伏革菌胞外纖維素酶活作為高效生防菌株篩選的指標之一。

另外，在篩選過程中還發現大伏革菌的控制效率和其孢子懸浮液的濃度、異擔子菌的孢子懸浮液濃度以及這兩個菌株孢子比例密切相關［50]。1960年，Meredith［25]發現防治松樹根腐病所需的異擔子菌和大伏革菌孢子懸浮液濃度比例是1/10時最有效，但在防治挪威云杉時，比例為1/2.5，每種寄主要求的比例不一樣。而且防治效率和噴灑的大伏革菌孢子懸浮液的面積成一定數量關系，大伏革菌噴灑面積越大，異擔子菌侵染樹樁面積越小［51]。Dumas［52]在2011年得出，一些化學物質，如木質素磺酸銨（木銨，ALS）能夠刺激大伏革菌的萌發和生長，當大伏革菌孢子溶解于1%或2.5%的木銨溶液時，大伏革菌在任何溫度下的萌發率均比溶解于水中高，且其萌發管更長，將此懸浮液噴灑于伐樁表面時，大伏革菌能夠更快定殖于伐樁表面，進而防止異擔子菌侵染伐樁。

大伏革菌是一種有兩極雜交系統的異核體真菌，通過配對實驗和DNA印跡分析得出，歐洲的大伏革菌菌株之間是互交可育的，而且其歐洲種群和北美洲種群間也是互交可育的。因此，也可以通過優良菌種雜交來達到提高大伏革菌防治效率的目的［24]。

6 結語

大伏革菌菌株作為防治針葉樹根腐病的有效菌株已經被廣泛使用。但隨著野外防治時間增加，大伏革菌優良基因退化，且病原菌形成一定的抗性。此時，使用新的篩選方案對于大伏革菌的廣泛應用具有一定的好處。隨著分子生物學、轉錄組學及基因組學等相關技術的發展，我們可以將研究目光聚焦在與大伏革菌自身拮抗能力相關的基因及拮抗異擔子菌過程中相關基因轉錄水平的變化上，利用分子育種技術培育高效大伏革菌。

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