天然蝦青素提取及分離純化研究進(jìn)展

武一琛，楊慧茹，方園，任秀蓮

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東威海264209）

蝦青素（Astaxanthin）即 3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮，由于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的共軛不飽和雙鍵，是一種極強(qiáng)的抗氧化劑，在抗氧化、著色、促進(jìn)動(dòng)物繁殖、增強(qiáng)人體免疫能力、保護(hù)心腦血管及中樞神經(jīng)方面具有優(yōu)良的生物學(xué)功能[1]，可以作為自由基清除劑和免疫調(diào)節(jié)劑[2]等應(yīng)用。

天然蝦青素富含于蝦蟹的殼、雨生紅球藻、法夫酵母等[3]。目前我國(guó)海洋蝦蟹制品下腳料利用率極低，大部分都是直接丟棄。如果把蝦蟹制品的下腳料加以回收，提取其中的蝦青素并進(jìn)行有效的利用，在給企業(yè)帶來(lái)不菲的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也減少了環(huán)境的污染，提高了蝦蟹下腳料的綜合利用率，具有極其廣闊的應(yīng)用前景。雨生紅球藻和法夫酵母生長(zhǎng)周期短，便于人工的養(yǎng)殖和控制，在提取天然蝦青素方向同樣有巨大的發(fā)展空間，近年來(lái)一直是國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

1 天然蝦青素提取工藝

天然蝦青素的提取方法有堿提法、酸溶法、有機(jī)萃取法、負(fù)壓空化法、酶解法、超臨界流體萃取法、微波處理提取法等，其中堿提法和酸溶法由于工藝落后，需要消耗大量堿和有機(jī)酸，直接導(dǎo)致污水排放增加，對(duì)環(huán)境中水源污染嚴(yán)重，近幾年已逐漸退出歷史舞臺(tái)。

1.1 有機(jī)萃取法

有機(jī)萃取法是通過(guò)有機(jī)溶劑萃取而使目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行富集從而分離。常用的有機(jī)萃取劑有乙醇、丙酮、甲醇、苯、石油醚等，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的極性和其它理化性質(zhì)，不同的有機(jī)溶劑的萃取效果不同。

MIQUEL GIMENO 等[4]通過(guò)用乙醇，丙酮，1，1，1，2-四氟乙烷液體溶劑對(duì)蝦殘留物萃取天然游離蝦青素，通過(guò)HPLC分析，丙酮萃取游離蝦青素的提取率最高，達(dá)115 μg/g蝦殘留物。此外，液態(tài)的四氟乙烷為首次作為溶劑成功提取分離出天然蝦青素。這與Ruenngam D等[5]的研究結(jié)果結(jié)論一致。Ruen-ngam D研究發(fā)現(xiàn)：利用丙酮、甲醇、乙醇、乙腈等有機(jī)溶劑萃取雨生紅球藻中的蝦青素，丙酮的提取率最高。

絕大多數(shù)的有機(jī)溶劑有毒性，隨著科技的發(fā)展和標(biāo)準(zhǔn)的提高，殘留的有機(jī)溶劑的毒性大大制約了有機(jī)萃取法的發(fā)展，于是各種新型方法不斷涌現(xiàn)。

1.2 負(fù)壓空化法

負(fù)壓空化法是一種新興的提取方法，通過(guò)負(fù)壓空化氣泡產(chǎn)生劇烈的機(jī)械振動(dòng)，從而使細(xì)胞壁破裂，目標(biāo)提取物從中分離出來(lái)。由于負(fù)壓產(chǎn)生的強(qiáng)烈的壓強(qiáng)差，使提取溶劑在瞬間進(jìn)入細(xì)胞壁，大大縮短了提取分離的時(shí)間，具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。目前研究采用負(fù)壓空化法提取天然蝦青素的主要有東北林業(yè)大學(xué)等。

祖元?jiǎng)偟萚6]對(duì)負(fù)壓空化法進(jìn)行了優(yōu)化和處理，研究發(fā)現(xiàn)：提取溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液、提取時(shí)間為35 min、通氣量為0.2 m3/h時(shí)，為提取法夫酵母中的蝦青素的最佳工藝參數(shù)，且不會(huì)破壞法夫酵母的細(xì)胞壁。

1.3 酶解法

酶解法是對(duì)原料蝦殼蟹殼進(jìn)行預(yù)處理后，加入一定的具有生物活性的酶對(duì)其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，沉降分離蛋白質(zhì)的同時(shí)分離制取蝦青素的方法。Toshihiro Nagao等[7]利用銅綠假單胞菌脂肪酶分離出蝦青素，趙儀等[8]研究發(fā)現(xiàn)利用木瓜蛋白酶處理廢棄的蝦殼，使蛋白質(zhì)沉降同時(shí)分離蝦青素的方法比利用有機(jī)溶劑提取的提取率提高了19.879%，達(dá)到63.059μg/g。蹇華麗等[9]采用單因素及均勻?qū)嶒?yàn)法將環(huán)狀芽孢桿菌胞壁溶解酶作用于法夫酵母，研究發(fā)現(xiàn)了破壁提取蝦青素的最佳酶作用條件，即粗酶液pH為5.0，體積為33 mL（酶量1 603.8 U/g干酵母），溫度37℃，100 r/min振蕩反應(yīng)16.5 h蝦青素的提取率可達(dá)到98%以上。姜淼等[10]研究?jī)?nèi)源酶輔助提取蝦殼中的天然蝦青素的實(shí)驗(yàn)也取得了一定進(jìn)展。

為解決直接加酶導(dǎo)致成本過(guò)高的問(wèn)題，可以嘗試將產(chǎn)酶菌株與法夫酵母或者雨生紅球藻共同進(jìn)行培養(yǎng)[11]，但是由于適宜的生長(zhǎng)條件：pH、水分、培養(yǎng)基成分、溫度等都不相同，所以該方法進(jìn)展緩慢。酶解法提取的蝦青素具有無(wú)毒、無(wú)溶劑殘留、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，只要解決了成本問(wèn)題，酶解法分離蝦青素就可以產(chǎn)業(yè)化，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和發(fā)展前景。

1.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取技術(shù)利用超臨界流體的性質(zhì)，高壓條件時(shí)與蝦殼粉碎物接觸并混合，萃取出其中的蝦青素，之后再利用改變條件的方法使超臨界流體中的萃取物分離出來(lái)。超臨界流體萃取法在蝦青素的提取方面的主要手段是超臨界CO2流體法。

Siti Machmudah等[12]研究超臨界CO2流體法提取天然蝦青素，發(fā)現(xiàn)以乙醇作為夾帶劑時(shí)，提取率更高。屈毅等[13]運(yùn)用超臨界CO2流體法研究發(fā)現(xiàn)：最佳萃取工藝參數(shù)為萃取壓力40 MPa，萃取溫度60℃，此時(shí)蝦殼中蝦青素的提取率可達(dá)到80.5%，并且得到的副產(chǎn)物（蝦油等）較少。Hyun-Seok Youn等[14]，劉洪超等[15]也探討了超臨界CO2流體提取蝦青素的方法。

超臨界流體萃取法是利用物理原理對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離的方法，無(wú)毒性和有害殘留，而且分離較徹底。同時(shí)，超臨界流體法目前只是處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，想要投入工業(yè)生產(chǎn)中存在機(jī)器費(fèi)用及維修費(fèi)用高、生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜、整個(gè)工藝流程具有不確定隱患的一系列困難。已經(jīng)有越來(lái)越多的專家學(xué)者投入到了這方面的研究中。

1.5 微波處理提取法

微波處理提取法是用不同波長(zhǎng)和頻率的微波處理含有目標(biāo)提取物的混合物，使其理化性質(zhì)發(fā)生改變而提高提取率的方法。目前微波處理提取法用于天然蝦青素分離提取的研究還處于初步的嘗試階段。Liyan Zhao等[16]研究發(fā)現(xiàn)在條件：微波功率為141 W，提取時(shí)間為83 s，溶劑用量9.8 mL，提取4次時(shí)，100 mg雨生紅球藻的干燥粉末可以提取約（594±3.02）μg天然蝦青素，這一研究創(chuàng)造了微波法用于提取天然蝦青素的記錄。

2 天然蝦青素分離純化工藝

純化就是把經(jīng)過(guò)粗提的樣品中所含有的雜質(zhì)除去，使目標(biāo)物質(zhì)的純度最大化的過(guò)程。常用的初級(jí)分離純化方法分為：液-液萃取、沉淀法、膜分離法、結(jié)晶法等。更高級(jí)的分離純化還有：薄層層析、柱層析、高效液相色譜等方法[17]。

針對(duì)天然蝦青素極其不穩(wěn)定、易分解、易變質(zhì)的性質(zhì)，學(xué)者們對(duì)天然蝦青素的分離純化做了多層次、多角度的研究，并取得了一些成果。

2.1 薄層層析

薄層層析（Thin Layer Chromatography，TLC）的固定相多為硅膠，不會(huì)對(duì)蝦青素產(chǎn)生影響，但由于薄層層析的分離度不高，結(jié)果受外界干擾因素大，重現(xiàn)性差，不便于實(shí)驗(yàn)操作，所以對(duì)操作過(guò)程要求極高。

郭建瑞等[18]在研究中選用石油醚、丙酮、乙酸乙酯兩兩組合作為流動(dòng)相進(jìn)行比較分析。通過(guò)改變其組成比例發(fā)現(xiàn)：石油醚乙酸乙酯質(zhì)量比為2∶1（體積比）的展開(kāi)劑分離效果較好，薄板上分離出清晰的4個(gè)點(diǎn)。陳興才等[19]在研究蝦青素分離純化時(shí)，也應(yīng)用了薄層層析的方法。

2.2 柱層析

柱層析是最常用的純化方法之一，與其他色譜方法相比，柱層析設(shè)備低廉，更換固定相和流動(dòng)相方便；雖然柱效不是特別高，但是利用不同固定相和流動(dòng)相的組合能夠?qū)崿F(xiàn)一些相對(duì)簡(jiǎn)單樣品的分離與純化，應(yīng)用范圍很廣。

黃萌[20]在蝦青素的分離純化中采用柱層析的方法，游離蝦青素在流動(dòng)相為正己烷與丙酮1∶1（體積比）時(shí)被洗脫下來(lái)，純度達(dá)到99.36%。楊磊等[21]采用連續(xù)中壓硅膠柱層析純化蝦青素得到純度大于97%的蝦青素產(chǎn)品，平均回收率大于60%。張琇等[22]以聚酰胺為固定相，獲得蝦青素的純度為92.9%。

2.3 高效液相色譜法

高效薄層色譜法（High Performance Thin Layer Chromatography，HPTLC）已經(jīng)在天然產(chǎn)物的分離與純化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，成為一種簡(jiǎn)便、高效的分析方法。

陳興才等[17]使用高效液相色譜法結(jié)合折光示差檢測(cè)器對(duì)蝦青素的純度進(jìn)行了測(cè)定達(dá)到98%以上。Karsten Holtin[23]等也利用HPLC分析出了蝦青素的合適吸收值。牟志春等[24]建立了蝦青素手性異構(gòu)體分離和檢測(cè)的HPLC方法，用來(lái)快速鑒別養(yǎng)殖三文魚是否使用了人工合成蝦青素。

與薄層層析和柱層析相比，高效液相色譜的儀器價(jià)格高昂，需要定時(shí)維修檢查，使用時(shí)對(duì)儀器的磨損度大，無(wú)法在工業(yè)企業(yè)中大規(guī)模普及。

3 結(jié)語(yǔ)及展望

由于蝦青素本身極其不穩(wěn)定的性質(zhì)，在其提取與分離純化中有重要影響。在蝦青素的提取中，負(fù)壓空化法、酶解法、超臨界流體萃取法、微波處理提取法都是一些新興的分離方法，具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，這些方法會(huì)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)；在分離純化方面，層析法應(yīng)用最為廣泛，HPLC法分離效果更好，造價(jià)高。

蝦青素具有抗氧化、著色等功效，梁春瑋等[25]總結(jié)出蝦青素具有明顯的抗癌和改善人體視網(wǎng)膜和骨質(zhì)量的功效，在藥物及食品方面應(yīng)用廣泛；同時(shí)具有顯著的著色功能，未來(lái)可以研究用蝦青素代替被禁止使用的蘇丹紅IV給食品進(jìn)行染色。同時(shí)，我們要看到國(guó)外已經(jīng)有成熟的蝦青素生產(chǎn)技術(shù)和專利，如日本的Toshihiro Nagao等[7]已經(jīng)把酶解法分離雨生紅球藻中的蝦青素應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，如果國(guó)內(nèi)在這個(gè)領(lǐng)域有所成就，對(duì)蝦青素的價(jià)格居高不下和技術(shù)的掌握都有重大意義。

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