反復腦缺血再灌注小鼠造模影響因素的Logistic回歸分析※

田元祥 趙建新 徐 蕾 王奕力 孫 奇 王先敏

(中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700;新疆維吾爾自治區中醫藥研究院科研科，新疆 烏魯木齊 830000)

反復腦缺血再灌注模型(repeated cerebral ischemiareperfusion，RCIR)在造模過程中，實驗小鼠死亡率極高。我們在長期研究過程中觀察到，對RCIR造模技術陌生的手術操作者，實驗小鼠死亡率在60% ～80%左右，經過規范培訓的熟練手術操作者，實驗小鼠死亡率在20%～40%左右。為了探討造模過程中與造模結局相關的影響因素，我們對RCIR造模過程中小鼠體質量、操作者因素與造模結局之間的關系進行研究，以期降低造模過程中實驗動物的死亡率，結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與環境 取健康SPF級雄性昆明小鼠48只，其中1只未手術，47只進行RCIR造模。適應飼養7 d后，體質量 32.5 ～37.7 g，平均(35.11 ±1.41)g。由北京市華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證號:SCXK(京)2009－0007。實驗在北京華大蛋白質研發中心有限公司清潔級動物室進行，實驗動物室許可證號:SYXK(京)2013－0034。

1.2 造模與記錄方法 取47只雄性昆明小鼠，造模采用文獻［1］成熟方法，第1次缺血20 min后，松開夾閉的血管再灌注10 min，再次缺血20 min。在適應飼養時對每只小鼠進行編號，記錄每只小鼠體質量。在造模過程中始終標明小鼠編號進行跟蹤，直至該鼠出現造模結局(成活或死亡)，2位操作員的造模成活情況分別記錄。為了方便描述，對結局進行定義。造模結局A:是指在第1次缺血時死亡;造模結局B:是指在第2次缺血時死亡;造模結局C:是指在手術第2 d死亡;造模結局D:指存活;造模結局E:是指造模結局A、B、C的總和。2位操作員年資相仿，并經過同期規范培訓，分別記為操作員X和操作員W，操作員X造模25只，操作員W造模22只。

1.3 統計學方法 應用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，根據數據情況分別采用單因素方差分析、卡方檢驗、t檢驗及二分類Logistic回歸分析法。

2 結果

2.1 小鼠體質量對4種造模結局的影響 見表1。

表1 小鼠體質量對4種造模結局的影響 ±s

表1 小鼠體質量對4種造模結局的影響 ±s

n 體質量(g) F值 P值造模結局A 10 35.16 ±1.73造模結局 B 9 35.09 ±1.17 0.006 3 0.999 3造模結局 C 3 35.17 ±0.21造模結局D 25 35.10 ±1.49

表1數據采用單因素方差分析法分析，4種造模結局的小鼠體質量無統計學差異(F=0.006 3，P=0.999 3)。

2.2 小鼠體質量對2種造模結局的影響 造模結局A、B、C都是小鼠死亡，只是發生的階段不同，為了消除這3種階段對結果可能出現的影響，將造模結局A、B、C合并，即造模結局E。采用t檢驗方法對結果進行分析，結果見表2。

表2 小鼠體質量對2種造模結局的影響 ±s

表2 小鼠體質量對2種造模結局的影響 ±s

n 體質量(g)t P造模結局 E 22 35.13 ±1.35－0.076 5 0.939 4造模結局D 25 35.10 ±1.49

由表2可見，2種造模結局小鼠體質量比較差異無統計學意義(t=－0.076 5，P=0.939 4)。

2.3 2位操作員小鼠造模結局比較 造模結局A、B、C、D中，C只有3例，其中操作員W 1例，操作員X 2例，例數太少，不符合統計學檢驗方法的要求，因此將造模結局B、C合并為B+C計算，采用卡方檢驗對結果進行分析，結果見表3。

表3 2個操作員小鼠造模結局比較 只

由表3可見，2個操作員之間小鼠造模結局未見統計學差異(χ2=2.796，P=0.247 1)。

2.4 2位操作員3種造模結局小鼠體質量比較 基于造模結局小鼠體質量，采用t檢驗對結果進行分析，結果見表4。

表4 2位操作員3種造模結局小鼠體質量比較

由表4可見，3種結局小鼠體質量在2個操作員之間均未見統計學差異(均P＞0.05)。

2.5 2位操作員2種造模結局小鼠比較 表3、4是基于A、B+C、D 3種造模結局分類進行的統計分析，是否分類過多會對結果有明顯影響。因此，將造模結局合并成2種:造模結局E和D。D是所有存活的小鼠，E是所有死亡的小鼠。采用χ2檢驗對基于小鼠數的結果進行分析，結果見表5。

表5 2位操作員2種造模結局小鼠比較 只

由表5可見，2個操作員之間造模小鼠成活率無統計學差異(χ2=0.997，P=0.318 0)。

2.6 2位操作員2種結局小鼠體質量比較 在表5基礎上，又基于2種造模結局小鼠體質量，采用t檢驗對結果進行分析，結果見表6。

由表6可見，2種結局小鼠的體質量在2位操作員之間均未見統計學差異(P＞0.05)。

表6 2位操作員2種結局小鼠體質量比較 ±s

表6 2位操作員2種結局小鼠體質量比較 ±s

造模結局n E體質量(g) n D體質量(g)操作員X 10 34.84 ±1.49 15 34.85 ±1.62操作員 W 12 35.38 ±1.22 20 35.47 ±1.25 t 0.908 4 1.070 7 P 0.376 0 0.295 7

2.7 2位操作員和體質量對小鼠造模結局的影響 進行二分類Logistic回歸分析，以造模結局E、D為因變量，以體質量和操作員為自變量，檢驗水準α設為0.05，分析2個操作員和體質量對小鼠造模結局的影響，結果見表7。

表7 2種結局小鼠二分類Logistic回歸分析

由表7可見，操作員及體質量與造模結局無明顯影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 在一定范圍內，小鼠體質量對造模結局無影響 文獻研究發現，實驗動物的體質量對造模結局有一定的影響［2－3］。如趙洪云等［2］在大鼠心肌梗死模型制作中發現，大鼠的體質量過小，實驗器官也小，手術操作難度大，對手術創傷的耐受性差;體質量過大，術后死亡率明顯增高。甄毅嵐等［3］研究發現，體質量小，＜20 g的小鼠頸部血管易分離，操作簡單，但體質差，成活率低;體質量大，＞30 g的小鼠，頸部脂肪較多，實驗中分離血管的難度加大，容易造成血管破裂，影響造模的成功率。本研究采用體質量在32.5～37.7 g之間的小鼠研究表明，體質量對實驗動物造模結局未見明顯影響(P＞0.05)，與文獻結果相反。可能與甄毅嵐等［3］采用的小鼠體質量在20～39 g較寬范圍不同，即本實驗結果能夠說明小鼠體質量在32.5～37.7 g之間，體質量對造模結局沒有影響，其他體質量范圍的影響有待于以后研究。

3.2 對造模結局無影響的體質量差可以擴大到5.2 g 選擇什么范圍體質量的小鼠對造模結局影響小，以往的實驗中一般掌握為5 g，但沒有研究數據作為佐證，文獻的認識也不一致［4－5］。王芙蓉等［4］根據經驗認為，小鼠的體質量差別不超過7 g，對梗死體積就沒有顯著的影響。但這是經驗認為，沒有實驗研究的科學依據。甄毅嵐等［3］將4 g作為一個分組的區間，也未對4 g是否對研究結果有影響做研究數據分析。本實驗采用單一性別的雄性小鼠，體質量最小為 32.5 g，最大為 37.7 g，跨度為 5.2 g，并提供了具體的研究數據進行統計學分析，結果在這個體質量范圍內，體質量對造模結局沒有影響。所以，能有科學根據地說，對造模結局無影響的體質量差可以擴展到5.2 g。

3.3 年資相仿并經過同期規范培訓的操作員對造模結局無影響 為了規范化實驗研究的操作，本實驗選取了未接觸過本實驗造模流程的2位操作員，同期進行規范化實驗方法培訓，并進行了2批次50只小鼠的預實驗，然后投入本次正式實驗中。在相同的時間和環境中，使用相同的實驗器械，結果表明經過同期規范培訓年資相仿的實驗員對造模結局無影響(P＞0.05)。結果提示，實驗前規范化的培訓和一定數量的預實驗，操作人員的實驗水平便可以達到實驗要求。

［1］ 趙建新，田元祥，李國明，等.擬血管性癡呆小鼠模型皮層及海馬細胞病理組織學動態觀察［J］.中國病理生理雜志，2000，16(11):1214－1216.

［2］ 趙洪云，管慧紅，鐘雪云，等.開胸冠狀動脈結扎法制作大鼠心肌梗死模型［J］.國外醫學:內科學分冊，2005，32(12):540－542.

［3］ 甄毅嵐，王亞男，李晟，等.線栓法制備不同體重KM小鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的建立及評價［J］.中國實驗動物學報，2013，21(2):39－44，插5.

［4］ 王芙蓉，姜永生，肖文伍，等.頸內動脈線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注模型［J］.卒中與神經疾病，2003，10(2):112－114.