Tail-Cuff技術改良大鼠頸部異位心臟移植模型的效果觀察

張金敏，張松林，魏 蕾

(1武漢大學醫學院，武漢430071;2三峽大學心血管病研究所)

大鼠頸部心臟移植模型由Heron［1］于1971年創立，該模型具有手術創傷輕、移植物觀察靈敏等優點。但由于頸總動脈與升主動脈直徑差別較大，該方法對顯微技術要求較高，手術時間長，移植物缺血損傷加重，從而限制了其在醫學研究中的廣泛應用。較多文獻［2～5］報道，利用套管技術(Cuff技術)對頸部異位心臟移植模型進行改良，可明顯縮短手術操作時間，提高手術成功率;但由于在Cuff管的根部缺乏固定的支撐點，翻轉血管時Cuff管易滑動，手術往往需花費較長時間。2012年9月～2013年3月，本研究在總結我們以前應用Tail-cuff技術帶尾套管法建立小鼠頸部異位心臟移植模型的基礎上［6，7］，應用靜脈內導管制作成帶有尾巴的套管(Tail-cuff)對大鼠頸部異位心臟移植模型的操作進一步改良。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用清潔級封閉群Wistar大鼠(200～250 g)和SD大鼠(230～300 g)，雌雄不限，分別由武漢大學實驗動物中心和華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2 手術材料 ZEISS手術顯微鏡(ZEISS光學儀器國際貿易有限公司);顯微手術器械包(寧波醫用縫針有限公司);5-0～10-0顯微縫線(上海浦東金環醫療用品有限公司)。應用22 G和20 G靜脈內套管(BD IntimaⅡTM，蘇州BD公司生產)制作Tail-cuff管，該管體長約1.2 mm，尾長約0.5 mm，尾寬約為管周長的1/3～1/2;動脈套管內徑約為0.7 mm，靜脈套管內徑約為1.2 mm;管體中部劃一刻痕，以避免結扎的線結脫落。

1.1.3 主要試劑 肝素鈉注射液(2 mL/12 500 U)，St.Thomas液，3 g/L 戊巴比妥鈉鹽水溶液，4%多聚甲醛(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 采用SD大鼠→SD大鼠進行同系心臟移植(n=20)，Wistar大鼠→SD大鼠進行同種心臟移植(n=24)。供、受者麻醉均用3 g/L的戊巴比妥鈉鹽水溶液腹腔注射，劑量分別為30、40 mg/kg。所有操作由單人完成。

1.2.2 移植物獲取 參照既往文獻［2，8～10］并稍作改進，采用腹部正中切口，經下腔靜脈注射肝素2 mL(100 U/mL)，2 min后采用U形切口開胸，剪開心包后阻斷主動脈弓遠端，經頭臂動脈注射心臟冷停搏液5 mL，心表面輔以冰屑保護心肌。分別進行胸腺摘取、結扎切斷右上腔靜脈、右心耳及下腔靜脈、左上腔靜脈、左心耳、肺靜脈等結構的操作，分離主肺動脈間隙軟組織后，在頭臂動脈近心端切斷升主動脈及在左右肺動脈分叉水平切斷肺動脈遠端，供心取出后以4℃的生理鹽水沖洗，分離主肺動脈間隙，然后保存在4℃的St.Thomas液中。

1.2.3 受體血管準備 右頸部縱行切開皮膚，摘除右頜下腺及軟組織。暴露右頸外靜脈，結扎后去除分支。在右胸鎖乳突肌及氣管之間，暴露右頸動脈。近心端以無創血管夾阻斷后，分別在頸內外動脈及頸外靜脈分叉平面結扎切斷分支及屬支。近心端血管腔以肝素鹽水沖洗。在頸外靜脈近心端游離緣以10-0縫線縫置1針，然后帶針線一起穿過帶尾的靜脈套管(尾部向血管夾)。用顯微血管鑷夾住靜脈遠心端并稍向上提，用另一顯微鑷把靜脈套管盡可能推向近心端，然后用血管夾把套管尾巴及近心端血管同時固定。最后用兩把顯微鑷對血管游離緣進行翻卷，8-0絲線環形結扎固定在預先劃好的刻痕上。同法準備右頸總動脈。

1.2.4 移植物植入 供心表面輔以一薄層棉墊，間斷性注射4℃生理鹽水以減輕供心熱缺血損傷。右頸外靜脈套管與供心肺動脈連接，用一預置的8-0絲線環形結扎固定;同法連接右頸總動脈套管與供心升主動脈。按順序移去右頸外靜脈及頸總動脈近心端血管夾。心臟移植物顏色迅速由蒼白轉為紅潤，60 s左右復跳。以5-0縫線連續縫合頸部切口。

1.2.5 術后觀察與處理 術后腹腔注射生理鹽水2 mL，一次性肌注青霉素鈉(500 U/10 g)。獨籠飼養，保溫。每日觸診頸部心跳情況以評估心功能，持續心跳≥72 h定為手術成功。分別于移植后第5天和第28天對同種移植物和同系移植物取心肌組織，以4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，進行HE染色。

1.2.6 主要觀察指標 記錄總操作時間、手術成功率、手術并發癥、移植心存活時間及病理學改變。

2 結果

2.1 基本情況 共44只大鼠正式實驗，20只同系移植，24只同種移植，手術成功率100%(44/44)。沒有麻醉、出血和血栓形成等并發癥。移植時間(40.2±6.8)min，翻卷血管和供受體血管連接時間分別為(3.8±1.1)、(2.7±1.3)min。同種移植物生存時間為(6.7±1.8)d，同系移植物生存時間超過28 d。

2.2 病理學切片觀察 同系移植組心肌組織形態大致正常，僅見少量炎性細胞浸潤;同種移植組心肌組織見大量彌漫性多類型細胞浸潤，伴水腫、出血和心肌細胞壞死。

3 討論

大鼠頸部心臟移植具有明顯優勢［11，12］:①創傷小;②感染率低;③易于觀察心跳情況;④術后存活率高等。但因大鼠血管較細且升主動脈與頸總動脈口徑相差較大，進行顯微吻合較為困難。套管技術的引入，大大縮短操作時間及心臟缺血時間。但套管技術的核心是如何把游離緣的血管翻卷到套管上并固定。在用套管法建立小鼠頸部心臟移植模型中，Matsuura等［13］的方法是在受體血管游離緣縫置3針固定牽引線，然后均勻用力翻卷，需要雙人操作，亦需要一定的顯微外科操作基礎。Wang等［14］及宋光民等［2］的方法是將供心的無名動脈套在備好的受體頸總動脈套管外，將翻轉好的供心肺動脈插入受體頸外靜脈內，結扎固定。我們的體會是肺動脈主干很短，不利于制作靜脈套管，且可人為縮小血管口徑。此外，該方法導致移植物血管蒂較長，易扭曲受壓;套管根部不能固定，翻卷血管時套管易于滑動，往往花費很長時間翻卷血管，加重心肌缺血。而有的研究者為了固定套管根部，在血管近心端插入一個針芯［15，16］，這樣容易損傷血管內膜導致血栓形成。

本實驗中，我們應用Tail-cuff管，很好地解決了套管根部缺乏支撐點的問題。把套管尾巴與血管同時固定在同一血管夾中，套管根部不再滑動，極易翻卷游離緣血管。此外，用22 G和20 G靜脈留置管制作Tail-cuff管，壁薄，內徑較大，因此供心血流量增加，靜脈回流通暢;右頸總動脈與升主動脈連接，縮短移植物血管蒂長度避免扭曲受壓;血管連接處為光滑而完整的血管內膜，對血管損傷輕，避免了血管內皮損傷而引起的血栓栓塞等并發癥。整個過程由單人完成，不需要專門練習顯微操作。該方法的使用，明顯減少了吻合口出血、狹窄等并發癥［11，17］，明顯縮短心臟缺血時間，主要是縮短了翻卷血管和連接血管的時間，并顯示了很高的手術成功率和術后生存率。但該方法仍然需要遵循一定的的學習曲線，本研究中正式實驗較為滿意的結果是在充分總結預實驗失敗的經驗上取得的。

此外，提高該手術成功率需要注意以下幾點:①套管中部劃一刻痕，避免線結環形固定后松脫，尤其是心臟復跳以后;②制作套管尾巴時其寬度為管周長的1/3～1/2，以避免套管尾巴與受體血管同時固定在同一血管夾后持續滲血;③避免翻卷時扭轉受體血管，導致血管連接后不甚通暢，因此在翻卷血管前記住固定線的方向很重要;④我們認為不必要切除右側胸鎖乳頭肌，一方面是避免慢性滲血，更重要的是供心移植后肺動脈和主動脈正好騎跨在胸鎖乳頭肌的兩側，避免了復跳后的供心扭轉。

總之，該方法的改進更利于供受體血管的吻合，縮短了心肌缺血時間，顯示了極高的手術成功率。因此，應用Tail-cuff技術對于建立大鼠頸部異位心臟移植模型顯示出一定的優越性，是一種理想的方法。該技術建立的模型適宜用于移植誘導的缺血再灌注損傷和免疫排斥反應的研究。

［1］Heron I.A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats［J］.Acta Pathol Microbiol Scand，1971，79(4):366-372.

［2］宋光民，宋惠民，李德才，等.套管連接法建立大鼠頸部心臟移植模型［J］.中華器官移植雜志，2000，21(4):218-219.

［3］Xiu D，Uchida H，To H，et al.Simplified method of heterotopic rat heart transplantation using the cuff technique:application to sublethal dose protocol of methotrexate on allograft survival［J］.Microsurgery，2001，21(1):16-21.

［4］劉忠民，關兆杰，沈文律.大鼠頸部心臟移植中動脈套疊吻合的應用［J］.中國修復重建外科雜志，2004，18(1):63-65.

［5］黃雪珊，陳道中，陳良萬.改良法建立頸部心臟移植慢性排斥反應模型［J］.中國修復重建外科雜志，2008，22(12):1508-1510.

［6］Zhang SL，Sun ZQ.Improvements of mouse cervical heterotopic heart transplantation model using the Tail-Cuff technique［J］.CRTER，2010，14(31):5583-5586.

［7］張松林，孫宗全，于利等.誘導受體產生一氧化碳對小鼠心臟移植排斥反應的抑制作用［J］.中華器官移植雜志，2012，33(4):241-245.

［8］王瀟，潘鐵成，陳濤.大鼠頸部異位心臟移植模型的改進［J］.山東醫藥，2006，46(9):22-23.

［9］陳浩，梅運清，Michael A Solomon.大鼠腹腔內心臟移植模型的構建和體會［J］.中華醫學雜志，2012，92(24):1715-1718.

［10］Wen P，Wang X，Wang J，et al.A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats［J］.Transplant Proc，2013，45(6):2522-2526.

［11］Ma Y，Wang G.Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats:cervical and abdominal heart［J］.Exp Clin Transplant，2011，9(2):128-133.

［12］Wheatley DJ.The potential of the heterotopic rat heart transplant model［J］.Transplantation，2002，73(9):1382-1383.

［13］Matsuura A，Abe T，Yasuura K.Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique［J］.Transplantation，1991，51(4):896-898.

［14］Wang Q，Liu Y，Li XK.Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice［J］.Microsurgery，2005，25(1):76-79.

［15］高開柱，孫宗全，杜心靈，等.套管法建立小鼠頸部心臟移植模型的探討［J］.華中科技大學學報(醫學版)，2006，35(5):638-640.

［16］馮劍鍔，孫宗全.應用Cuff技術建立小鼠異位心臟移植模型［J］.中華實驗外科雜志，2005，22(12):1576-1577.

［17］Shan J，Huang Y，Feng L，et al.A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats［J］.J Surg Res，2010，164(1):155-161.