類風濕關節炎患者血漿Ghrelin水平變化及其基因C408A多態性分析

楊梅花，王向紅，馮忠軍，米 嬌，張志紅

(1石家莊市第一醫院，石家莊050000;2石家莊市第六醫院;3河北醫科大學第三醫院)

Ghrelin是1999年日本科學家Kojima從大鼠胃中分離出來的一種活性多肽，含28個氨基酸，是促進生長激素受體活性的內源性配體，故又稱生長激素［1］。近年研究［2］發現，Ghrelin 能促進生長激素釋放，且具有抑制炎癥因子釋放、降低血壓、增進食欲、促進細胞增殖、調節糖代謝等作用。本研究觀察了120例類風濕關節炎(RA)患者血漿Ghrelin水平并分析了其基因C408A(Leu72Met)多態性，旨在探討Ghrelin在RA發病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月～2010年12月河北省人民醫院、河北醫科大學第三醫院、石家莊市第一醫院RA患者120例(RA組)，男46例，女74例;年齡27～79歲，均為漢族。均符合1987年美國風濕病協會和2009年ACR/EULAR制定的RA診斷標準，病程為1～28 a，RA疾病活動性評分系統(DAS28)評分為(3.7±1.14)分;均無其他自身免疫性疾病及傳染病。選擇健康體檢者150例為對照組，男64例，女85例;年齡21～70歲，均為漢族。兩組年齡、性別具有可比性。研究對象均簽署知情同意書，并經石家莊市第一醫院倫理委員會同意。

1.2 血漿Ghrelin檢測 兩組均抽取空腹靜脈血5 mL，其中2 mL采用ELISA法測定血漿Ghrelin水平，檢測試劑盒由上海蘭基生物有限公司提供，檢測方法嚴格按照試劑說明書操作;余3 mL以樹脂法提取DNA，保存于-70℃冰箱用于下述實驗。

1.3 Ghrelin基因C408A位點多態性檢測 采用聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法。查閱相關文獻及與GenBank核對序列設計引物，上游引物序列5'-GCTGGGCTCCTACCTGAGC-3'，下游引物序列5'-GGACCCTGTTCACTGCCAC-3'(北京賽百盛基因技術有限公司合成)。以50 ng/μL的 DNA為模板進行 PCR擴增。反應條件:預變性94℃ 5 min，變性94℃ 45 s，退火61℃45 s，延伸72℃ 45 s，循環30次;末端延伸72℃ 5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠確認后，繼以BsrI限制性內切酶(Fermentas公司)酶切，65℃水浴保溫4 h，于2%瓊脂糖凝膠上100 V/cm電泳30 min，紫外燈下觀測基因型。利用凝膠成像系統記錄電泳結果、觀測基因型。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統計分析。計算Hardy Weinberg平衡以判斷樣本的代表性。計量資料以±s表示，組間比較用SNK檢驗及單因素方差分析(One-way ANOVA)。構成比的比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿Ghrelin水平 RA組和對照組血漿Ghrelin 分別為(115.03 ±38.12)、(156.28 ±65.84)pg/mL，組間比較，P ＜0.05(F=27.531)。

2.2 Ghrelin基因型和等位基因頻率分布 兩組Ghrelin基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群體代表性。Ghrelin基因C408A存在堿基二態性C或A，對照組基因型為 AA 型1.4%、CA 型 27.3%、CC 型 71.3%，等位基因的頻率分布A為15.0%、C為85.0%，攜帶突變基因CA+AA的頻率為28.7%;RA組為AA型2.5%、CA 型 38.3%、CC 型 59.2%，基因頻數分布A為21.7%、C為78.3%，攜帶突變基因 CA+AA的頻率為40.8%。兩組基因型和等位基因頻率比較均有顯著差異，P 均 ＜0.05(χ2=6.317)。

2.3 RA組Ghrelin基因型與血漿Ghrelin水平、病程、DAS28評分的關系 基因型為CC、CA、AA者血漿 Ghrelin 分別為(167.42 ±53.7)、(124.66 ±47.3)、(93.41 ± 11.5)pg/mL，三者比較，P ＜ 0.05(F=26.414);平均病程分別為 1.7、5.8、5.2 a，三者比較，P ＜0.05(F=28.983);DAS28 評分分別為(3.48 ±1.21)、(3.95 ±1.16)、(3.82 ±1.03)分，三者比較，P ＞0.05(F=4.921)。

3 討論

RA是一種慢性全身性炎癥，其發病病因與機制尚未完全清楚，主要臨床表現為多滑膜關節炎和關節外病變，呈慢性、對稱性病變。RA屬于自身免疫炎性疾病，免疫復合物和類風濕因子是造成關節發生病變的重要因素之一。目前認為RA是環境因素與遺傳因素共同作用的結果，而且很多炎癥因子如IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-6及血管內皮生生長因子等在發病中起重要作用［3，4］。Ghrelin能促進免疫細胞增殖、抑制炎性反應因子釋放，在炎性反應中扮演重要角色;還能抑制T細胞，使細胞被炎性反應激活、mRNA 表達明顯升高［4］;抑制 TNF-χ誘導的單核細胞趨化蛋白(MCP-1)mRNA 表述［5，6］。Ghrelin的單核苷酸基因多態性與血漿Ghrelin水平的關系存在爭議，但前者可影響外周血液細胞中Ghrelin基因的mRNA表達，說明在免疫微環境的影響下Ghrelin很可能存在一個自分泌調節系統。三硝基苯磺酸誘導的結腸炎急性期小鼠Ghrelin及其受體mRNA表達明顯增高［7］，在抗中性粒細胞胞質抗體(ANCA)相關的血管炎、炎癥性直腸炎等急性炎癥期 Ghrelin 的 mRNA 表達亦增加［8，9］。本研究顯示，RA組血漿Ghrelin水平顯著低于對照組。提示Ghrelin可能參與了RA的發生、發展。

文獻［10］報道，甘肅地區回族人群 CC、CA、AA基因型比例分別為 70.8%、26.5%、2.7%。本研究進行的Ghrelin基因C408A多態性檢測顯示，兩組共發現87例雜合子、5例純合子、178例野生型，且組間基因型和基因頻率比較均有顯著差異。提示河北地區人群存在該位點變異，但基因型分布與上述文獻報道無顯著差異;CA型與純合AA型均可增加RA發病風險。可能機制為基因多態性由突變遺傳所致，但河北地區與甘肅地域相距較近。有研究［11］顯示，Ghrelin基因Arg51Gln位點多態性者血漿Ghrelin水平較低，而C408A位點多態性者血漿Ghrelin水平較高。亦有研究證實，C408A和Gln90Leu兩種Ghrelin多態性基因并不影響血漿Ghrelin水平［12］。本研究顯示，RA組不同基因型者血漿Ghrelin水平及病程存在統計學差異。說明Ghrelin基因C408A多態性可能影響RA患者血漿Ghrelin水平及RA發病風險，其中CA型和AA型可能與，RA病程延長有關。推測各研究結果不同的原因很可能是血漿Ghrelin水平主要與營養狀況有關。有研究［13］表明 Ghrelin基因A-501C多態性可增加RA的患病風險，但是并不會對RA的病情嚴重程度產生影響。本研究顯示RA組不同基因型者DAS28評分差異無統計學意義，與上述文獻一致。提示Ghrelin基因C408A多態性引起的Ghrelin血漿水平降低、發病提前及病程延長很可能與影響Ghrelin的正常功能及Ghrelin的mRNA表達，進而導致Ghrelin抗炎作用降低、RA相關致病炎性因子對機體產生相應破壞有關。

綜上所述，RA患者存在血漿Ghrelin水平降低及Ghrelin基因C408A位點變異，純合的AA型和雜合的CA型均可比野生的CC型增加RA患病風險增加，但Ghrelin基因可能并非河北漢族RA的主效基因。

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