茶樹蛋白質組學研究進展

程曉梅，黃建安,2，劉仲華,2，李 勤

（1. 湖南農業大學園藝園林學院茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙410128；2. 湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙410128）

蛋白質組概念是由澳大利亞學者MarcWilkins 和Keith Williams 首次提出，并由Wasinger 等第一次在出版物中使用，它研究的核心內容是蛋白質的動態變化和動態行為，即通過分析某一生物體、組織或細胞內的蛋白質組成成分、表達水平、修飾狀態和功能，了解蛋白質之間的相互作用及其聯系[1]，進而從整體水平上研究蛋白質的組成和調控規律[2]。植物蛋白質組學的研究落后于單細胞原核生物和真核生物蛋白質組學，而且與動物和酵母蛋白質組學相比還不完善，這與植物本身特點有關[3]。近年來，隨著蛋白質組學研究方法和技術體系的不斷完善，為植物蛋白質組學的研究提供了良好的技術平臺。目前，蛋白質研究的技術手段主要包括蛋白質樣品制備、電泳分離技術[4]、色譜分離技術[5]、質譜鑒定技術與生物信息學分析[6-8]等。

1 植物蛋白質組學產生的背景及意義

蛋白質組學是生物研究中發展最快的領域之一，它是在基因組學的研究成果和高通量的蛋白質分析鑒定技術得到突破的背景下產生的一門新興學科，基因組研究的發展是蛋白質組學產生的重要前提。植物蛋白質組學作為蛋白質組學的一個重要分支，是分子生物學時代的重要組成部分，為未來研究和發展植物生理學提供了堅實的基礎和理論依據。通過植物蛋白質組學的研究，能快速分離鑒定與控制植物重要農藝性狀的蛋白質，運用逆向遺傳學方法鑒定基因功能，再利用基因工程手段將優良的農藝性狀基因轉化農作物，以進一步提高作物產量、品質和抗逆性。

2 植物蛋白質組學研究的主要內容

植物蛋白質組學研究的主要內容包括：（1）植物環境蛋白質組學，研究與環境因素相關的蛋白質，主要是植物在生物（如病蟲害）和非生物（如干旱、高低溫、高鹽等）逆境脅迫條件下生理代謝、調控應答機制、生物間的相互作用機制以及植物激素的調節作用等。Wang 等為了研究植物的耐鋁機制，采用iTRAQ 標簽的定量蛋白質組學技術研究了水稻幼根響應鋁脅迫的蛋白質組學，發現鋁敏感和耐鋁的品種之間有106個差異蛋白點，耐鋁品種中與糖酵解途徑有關的酶的表達上調，通過qPCR 表明其中的8個蛋白質可能與耐鋁性有關[9]。（2）植物遺傳多樣性蛋白質組學，是以蛋白質組學標記為紐帶聯系基因多樣性和表型多樣性，進而了解植物種內和種間進化趨勢，一個自然群體的遺傳變異程度以及進行品種鑒定。Song 等發現小麥雜種及其親本間的一些差異蛋白，它們與能量代謝、信號轉導、細胞生長、疾病及防御等有關[10]。（3）植物突變體蛋白質組學，能夠揭示一些植物生理生態建成的機制，明確植物突變的分子機理，為植物發育分子生物學研究與應用提供新的研究資料。邵勤通過研究薄皮甜瓜葉色黃化突變體9388-1 和突變親本的蛋白質組學，發現黃化突變體的葉綠體核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、葉綠體放氧增強蛋白1 表達下調，可能與葉色黃化有關[11]。（4）植物發育相關蛋白質組學，主要研究每一個特定時期植物各個組織器官及細胞器內蛋白質的表達差異。Zhang 等利用2-DE 技術研究雜交水稻LYP9 及其親本在分蘗、開花、灌漿3個時期蛋白質組學的動態變化，親本和雜交LYP9 中與光合作用、糖酵解和防御有關的蛋白在開花和灌漿期表達較分蘗期均上調，雜交品種更明顯[12]。

3 茶樹蛋白質組學研究應用進展

茶樹是一類多年生常綠葉用經濟植物，原產于我國西南地區。隨著人們對茶葉研究的不斷深入，茶樹在基因組方面的研究已經取得了長足進展。1994年，Takeuchi 等構建了第一個茶樹cDNA 文庫，獲得了很多重要的茶樹基因[13]。陳亮等以龍井43 無性系新梢和實生苗新生幼根為材料，構建了我國第一個茶樹新梢與幼根cDNA 文庫[14]。黃建安等構建國內首張茶樹遺傳圖譜[15]。Shi 等首次利用高通量Illumina 測序技術獲得茶樹轉錄組深度數據庫，為茶樹研究基因表達、基因組和基因功能分析提供了重要的技術平臺[16]。楊華等利用茶樹轉錄組的高通量測序技術獲得的127 094 條Unigenes，共發掘了12 242個茶樹轉錄組SSR 功能性標記[17]。這一系列茶樹基因組方面的研究結果為開展茶樹蛋白質組學的研究打下了堅實的基礎。

3.1 茶樹蛋白質組學技術體系建立

隨著茶樹基因組研究的深入，茶樹蛋白質組學研究也在逐步展開。林金科等以茶樹芽葉為材料，通過優化雙向電泳體系中蛋白樣品制備、電泳和染色等條件建立了一種適合于茶樹蛋白質組學研究的改良方法，解決了茶樹芽葉中富含色素、多酚類化合物及其氧化產物等對雙向電泳嚴重干擾的問題[18]。李勤等通過比較TCA/丙酮沉淀法、酚-甲醇/醋酸銨沉淀法和改良的Tris-HCl抽提法，發現Tris-HCl 抽提法適合于茶樹蛋白質雙向電泳樣品制備[19]，并成功應用于安吉白茶生育期間蛋白質組學研究[20]。任燕通過對總蛋白提取方法、IEF 聚焦條件和SDS-PAGE 電泳條件等的優化，建立了一套適合于茶樹雌蕊總蛋白質雙向電泳的技術體系，可以獲得清晰、分辨率高、重復性好、堿性蛋白得到有效分離的雙向電泳圖譜[21]。

3.2 蛋白質組學在茶樹抗旱研究中的應用

水是植物生長必不可少的環境因素，缺水條件下植物可能發生枯萎甚至死亡。植物在干旱條件下其形態指標、生長指標、生理生化指標都會發生不同程度的變化。近年來，關于植物干旱脅迫下的蛋白質變化已成為植物逆境研究領域中的熱點。莊重光研究了不同水分處理下鐵觀音茶樹葉片的差異蛋白質組學，發現隨著茶樹葉片水勢的降低，蛋白質表達出現逐漸上升或下降的趨勢，表達豐度差異達3.0 倍以上的有56個蛋白點，其中上調表達31個，下調表達25個。同時發現不同水分處理顯著影響了參與光合作用的蛋白質表達情況[22]。張寶千也研究了不同灌溉情況下鐵觀音茶樹蛋白質的表達差異，發現他們之間表達豐度在3.0 倍以上的蛋白點有56個，其中4個蛋白點表達豐度差異在5.0 倍以上[23]。郭春芳等分析了茶樹幼苗在聚乙二醇模擬干旱脅迫下葉片蛋白組變化后發現，PEG 處理后葉片完整蛋白的表達量下降，降解片段的表達量上升，總蛋白量減少，并鑒定出14個不同的蛋白點，其中5個點是同一個蛋白，另9個是PEG 脅迫響應蛋白，它們對揭示茶樹響應干旱脅迫的分子機理奠定了基礎[24]。Chen 等研究了茶樹新鮮種子和經過12 h 干燥處理的種子蛋白組的變化，譜圖分析顯示干燥后23個與抗性、代謝和氧化還原相關的蛋白得到上調[25]。周林等探究了干旱脅迫下外源ABA 對溫室中培養的茶樹葉片蛋白質組的影響，發現18個差異蛋白點，其中2個表達上調的蛋白與糖酵解和光反應體系Ⅱ有關。同時發現通過外源脫落酸對不同干旱時間刺激的茶樹葉片進行處理，檢測到21個差異蛋白點與干旱脅迫有關，結果表明茶樹在干旱脅迫下，ABA 在改善蛋白質運輸、碳代謝和抗性蛋白的表達方面發揮著重要作用[26]。

3.3 蛋白質組學在茶樹抗寒研究中的應用

植物抗寒性是指植物忍耐和抵抗低溫的能力，在低溫脅迫下植物的蛋白質組成和表達量發生了變化。茶樹具有喜溫畏寒的特性，不同茶樹品種因原產地和遺傳差異對低溫脅迫表現出不同的適應能力。高永亮比較了4℃低溫和25℃室溫條件下舒茶早茶樹葉片蛋白質組的變化，發現低溫處理后上調表達的蛋白點有31個，減弱表達的有15個，這些差異蛋白點可能與低溫脅迫有關，對7個蛋白的肽質量指紋圖譜進行鑒定，6個為核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶蛋白家族，茶樹可能通過他們的表達上調來抵御低溫對茶樹光合作用的負效應，增加碳水化合物的合成；1個為轉酮醇酶，促使物質的相互轉換，以減少寒害[27]。Hu 等研究了福鼎大白茶在0℃以上和-2℃下葉片的蛋白質變化，發現38個重復性好的差異蛋白點，包括熱休克蛋白70 家族，S-腺苷甲硫氨酸合成酶，ATP 合酶等，這些蛋白質與茶樹的抗寒機制密切相關[28]。

3.4 蛋白質組學在茶樹其他抗性研究中的應用

杜娟研究了平陽特早茶樹在Pb 脅迫下，接種根內球囊霉菌和未接種根內球囊霉菌的茶樹葉片中蛋白質組差異，發現與未接種根內球囊霉菌相比，蛋白表達量顯著上升的蛋白點有7個，顯著下降的有8個。對于這些差異蛋白與茶樹抗Pb 脅迫的具體關系仍需進一步探究[29]。

茶樹在抵抗逆境脅迫時往往會表現出抗逆性狀，合成大量的脅迫誘導蛋白，提高茶樹的耐脅迫能力。如何增強茶樹生長適應性，提高抗寒、抗旱、抗病等能力，已日益成為茶樹栽培生產和品種選育中亟待解決的問題。因此，研究茶樹的抗性機制，對茶樹種質資源的開發利用、擴大引種范圍、品種選育和改良以及茶樹栽培生產等都具有十分重要的理論和實踐意義。

3.5 蛋白質組學在茶樹品質調控研究中的應用

兒茶素類是茶樹重要的品質成分及次生代謝產物，與茶樹的生長發育和茶葉的色、香、味品質形成關系密切，也是茶葉保健功能的主要成分，所以對高兒茶素含量的茶樹的研究意義重大。林金科等通過外源無公害化學因子的誘導使茶樹EGCG 含量提高20.15%～25.00%，并發現誘導出現和消失的特異蛋白分別有14種、8種，表達上調和下調相差10 倍的蛋白分別有11種和6種，這些差異蛋白在誘導過程中可能發揮著重要作用[7,30]。張立明等對“云莖63X”、“云莖63Y”和光照誘導的“云莖63Y”三類兒茶素含量依次升高的愈傷組織的蛋白質進行分析，分別得到684、607、568個蛋白點，共檢測到14個差異較大的蛋白質，包括谷胱甘肽S-轉移酶、WD40蛋白、咖啡酸-O-轉甲基酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、果膠甲酯酶等，他們分別參與了類黃酮的合成、轉運及調控，乙烯合成、糖酵解途徑和信號轉導等生理作用[31-32]。

3.6 茶樹花粉蛋白質組學研究

茶花粉富含蛋白質、氨基酸、脂肪酸、維生素和活性酶等多種有效成分，具有降血壓、抗衰老、增強免疫力等作用。花粉儲存的關鍵就是如何在長期的儲藏中花粉繼續維持原有的高活力水平，為此Li 等對室溫及-20℃低溫儲存6個月的茶花粉蛋白組進行了比較試驗，分別檢測到269 和396個蛋白質點，室溫儲存引起茶花粉內蛋白質損失，而在-20℃溫度下應激蛋白，核酸代謝類蛋白，脂肪代謝類蛋白，膜轉運蛋白豐度顯著升高，與防御和能量代謝相關的蛋白表達下調。這些結果表明，冷凍是保持茶花粉質量的最佳儲存方式[33]。

3.7 茶樹突變體蛋白質組學研究

通過蛋白質組學方法對基因突變引起的蛋白質表達變化進行研究可以得到植物遺傳學的重要數據，揭示植物生理生態過程的機制，對研究表型突變的內在生化過程提供指導。目前對茶樹突變體的研究報道較少，主要集中于某些主要生化成分和基因研究，而對于蛋白質組的研究幾乎是空白。安吉白茶是一種低溫敏感型的自然突變的白化茶樹，李勤等采用Tris-HCI 抽提法提取安吉白茶返白前期、白化期、完全復綠期3個時期的芽葉蛋白質，通過雙向電泳技術檢測到每個時期約1 000個蛋白點，表達豐度變化在1.5 倍以上的差異蛋白點有60個，對其中26個差異表達蛋白進行鑒定發現，它們是一些與物質及能量代謝、光合作用、蛋白質及RNA 加工有關的抗性蛋白和未知功能的蛋白質。安吉白茶階段性返白現象和高氨基酸含量可能與這些差異蛋白表達變化有關[20]。

3.8 茶樹亞細胞水平的蛋白質組學研究

亞細胞蛋白質組學是蛋白質功能和定位研究的必經之路。目前，大多數蛋白組研究者以亞細胞蛋白質組作為切入點，正將蛋白質組學推向一個更廣闊的領域[34]。在植物亞細胞蛋白質組學中研究較多的是葉綠體。人們對于茶樹的亞細胞水平的蛋白質組學研究進程還比較緩慢。張立明等通過差速離心法分離茶樹葉片的葉綠體，IEF/SDS-PAGE 雙向電泳結合銀染技術，鑒定得到茶樹葉綠體中約有350個蛋白質點，主要分布于等電點在3～5，并檢測到茶樹葉綠體內含有兒茶素合成相關酶PAL、DFR/LAR 和ANR[32,35]。

4 茶樹蛋白質組學研究瓶頸和發展前景

蛋白質組學的研究作為功能基因組學的重要支柱，是當今生命科學領域的前沿，不僅可以實現與基因組的對接與確認，而且還可以廣泛推動生命科學的基礎學科及分析、信息、材料等應用科學的發展。目前，植物蛋白質組學發展迅速，并取得了一些可觀的成果。而關于茶樹蛋白質組學的研究一直發展很慢，原因有：⑴相比于擬南芥和水稻等模式植物，茶樹蛋白質組學處于初級階段，蛋白提取過程中干擾物質較多，蛋白樣品的制備較困難；⑵截止目前，茶樹沒有完整的基因組，數據庫還不完善，即現有的蛋白質組局限于對已完成基因組計劃的理論預測的蛋白質組進行實證分析；⑶蛋白質組學的有些技術難將細胞組織內多種痕量調控蛋白分離顯示出來，而這類蛋白對于基礎與應用研究是極為重要的；⑷現有的質譜技術在蛋白鑒定中高效靈敏，但價格昂貴，技術推廣受到很大的限制。

我國茶樹品種多樣，種質資源豐富，分布區域廣泛。盡管當前茶樹蛋白質組研究的深度與廣度仍不及模式植物，但是近年來對茶樹蛋白質組學的研究，使得茶樹蛋白質的提取和鑒定技術逐漸被優化和完善，相關研究也為茶樹功能基因組學研究的深入開展創造了新的起點。針對以上問題，隨著2D-HPLC、2D-CE 及LC-CE 等新型分離技術和新理論的出現，生物質譜技術及生物信息學工具的進一步完善，茶樹蛋白質組學的研究將更加深入和廣泛，尤其是對于某些具有特殊優良性狀的茶樹品種，如具有強抗寒、抗旱、抗病蟲能力的“紫鵑”和簡單兒茶素含量較高的江華苦茶等，對它們的研究為認識茶樹的生長、發育、進化規律和代謝調控等生命本質指明方向。

[1]Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa‐Poljak A，etal.Progresswith gene‐product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium[J].Electrophoresis，1995，16(1)：1090-1094.

[2]Dunn MJ.ProteomicsComesofAge[J].Proteomics，2014，14(1)：1-2.

[3]Van Wijk KJ.Challenges and prospects of plant proteomics[J].Plant Physiology，2001，126(2)：501-508.

[4]PomastowskiP，BuszewskiB.Two-dimensionalgelelectrophoresis in the light of new developments[J].TrAC Trends in Analytical Chemistry，2014，53(1)：167-177.

[5]Cox J，Mann M.Quantitative，high-resolution proteomics for data-driven systemsbiology[J].Annual review ofbiochemistry，2011，80：273-299.

[6]Wu C，Dill AL，Eberlin LS，et al.Mass spectrometry imaging under ambient conditions[J].Mass spectrometry reviews，2013，32(3)：218-243.

[7]林金科.茶樹高EGCG的種質資源及外源誘導研究[D].福州：福建農林大學，2003.

[8]周瓊瓊，孫威江.適用于茶樹蛋白質組分析的雙向電泳優化體系的建立[A].第十六屆中國科協年會—分12茶學青年科學家論壇論文集[C].昆明：中國科學技術協會，2014.

[9]Wang ZQ，Xu XY，Gong QQ，et al.Root proteome of rice studied by iTRAQ provides integrated insight into aluminum stress tolerance mechanisms in plants[J].Journalofproteomics，2014，98：189-205.

[10]Song X，Ni Z，Yao Y，etal.Wheat(Triticum aestivum L.)root proteome and differentially expressed rootproteins between hybrid and parents[J].Proteomics，2007，7(19)：3538-3557.

[11]邵 勤.一個新的甜瓜葉色黃化突變體研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2013.

[12]Zhang C，Yin Y，Zhang A，et al.Comparative proteomic study reveals dynamic proteome changes between superhybrid riceand its parents at different developmental stages[J].Journal of plant physiology，2012，169(4)：387-398.

[13]Takeuchi A，Matsumoto S，Hayatsu M.Chalcone synthase from Camellia sinensis:isolation of the cDNAs and the organ-specific and sugar-responsive expression of the genes[J].Plant and Cell Physiology，1994，35(7)：1011-1018.

[14]Chen L，Zhao L-p，Gao Q-k.Generation and analysis of expressed sequence tags from the tender shoots cDNA library of tea plant()[J].PlantScience，2005，168(2)：359-363.

[15]黃建安，李家賢，黃意歡，等.茶樹AFLP分子連鎖圖譜的構建[J].茶葉科學，2005，25(1)：7-15.

[16]Shi C-Y，Yang H，Wei C-L，et al.Deep sequencing of the Camellia sinensis transcriptome revealed candidate genes for major metabolic pathways of tea-specific compounds[J].BMC genomics，2011，12(1)：131.

[17]楊 華，陳 琪，韋朝領，等.茶樹轉錄組中SSR位點的信息分析[J].安徽農業大學學報，2011，38(6)：882-886.

[18]林金科，鄭金貴，袁 明，等.茶樹蛋白質提取及雙向電泳的改良方法[J].茶葉科學，2003，23(1)：16-20.

[19]李 勤，黃建安，劉仲華，等.茶樹蛋白質雙向電泳樣品制備技術研究[J].茶葉科學，2011，31(3)：173-178.

[20]李 勤.安吉白茶新梢生育期間蛋白質組學及茶氨酸體外生物合成的研究[D].長沙：湖南農業大學，2011.

[21]任 燕，陳 暄，房婉萍，等.茶樹雌蕊總蛋白質雙向電泳分離體系的建立[J].茶葉科學，2013，33(5)：420-428.

[22]莊重光.不同水分處理下鐵觀音茶樹的生理機制及其差異蛋白質組學研究[D].福州：福建農林大學，2008.

[23]張寶千.鐵觀音茶樹應對調虧灌溉的生理與分子機理分析[D].福州：福建農林大學，2013.

[24]郭春芳.水分脅迫下茶樹的生理響應及其分子基礎[D].福州：福建農林大學，2008.

[25]Chen Q，Yang L，Ahmad P，et al.Proteomic profiling and redox status alteration of recalcitrant tea (Camellia sinensis)seed in response to desiccation[J].Planta，2011，233(3)：583-592.

[26]Zhou L，Xu H，Mischke S，et al.Exogenous abscisic acid significantly affectsproteome in tea plant(Camellia sinensis)exposed to droughtstress[J].HorticultureResearch，2014，1(29)：1-9.

[27]高永亮.茶樹葉片抗寒相關蛋白的篩選[D].合肥：安徽農業大學，2011.

[28]YongguangH，Yongzong L，Jian L.Comparativeproteomicsanalysisof tea leavesexposed tosubzerotemperature:Molecularmechanismoffreezeinjury[J].International Journal of Agricultural and Biological Engineering，2013，6(4)：27-34.

[29]杜 娟.根內球囊霉菌對茶樹抗鉛脅迫能力的調節效應[D].鄭州：河南農業大學，2013.

[30]林金科，鄭金貴，袁明，等.外源誘導提高茶樹EGCG含量過程的蛋白質組差異分析(英文)[J].茶葉科學，2005，25(2)：109-115.

[31]張立明，王云生，高麗萍，等.茶樹不同兒茶素含量愈傷組織的蛋白差異分析[J].中國農業科學，2010，43(19)：4053-4062.

[32]張立明.基于茶樹兒茶素生物合成的蛋白質研究[D].合肥：安徽農業大學，2010.

[33]Li J，Chen J，Zhang Z，et al.Proteome analysis of tea pollen(Camellia sinensis)underdifferentstorage conditions[J].Journalofagriculturaland food chemistry，2008，56(16)：7535-7544.

[34]齊 欣，崔繼哲，朱宏.葉綠體的蛋白質組學研究進展[J].現代生物醫學進展，2007，7(3)：440-442.

[35]張立明，劉亞軍，王云生，等.茶樹葉綠體及其蛋白的分離研究[J].激光生物學報，2011，20(6)：802-808.