小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

張淑莉，李素芬

（1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系檢驗(yàn)中心，陜西 西安 710021；2.陜西省地方病研究所，陜西 西安 710003)

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

張淑莉1，李素芬2

（1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系檢驗(yàn)中心，陜西 西安 710021；2.陜西省地方病研究所，陜西 西安 710003)

目的建立一種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的簡便方法。方法以無血清的RPMI1640培養(yǎng)液灌洗小鼠腹腔，分離獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，在含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活力，瑞氏染色計(jì)算純度，細(xì)胞吞噬墨汁顆粒測(cè)定其吞噬率，鑒定這些細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)獲得高純度的巨噬細(xì)胞，具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征。結(jié)論該方法是一種簡便的巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法。

小鼠；巨噬細(xì)胞；分離培養(yǎng)；鑒定

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，它在抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中起著非常的重要作用[1-2]。巨噬細(xì)胞來源于骨髓，它在機(jī)體中分布廣泛，主要分布于肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓、胸腺、胸腔、腹腔、血液、皮膚等多種組織器官。如何從這些組織器官中分離、純化獲得高純度、高活性的巨噬細(xì)胞，如何選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞提取及鑒定方法是體外細(xì)胞培養(yǎng)研究工作者的首要任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探索建立一種巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與鑒定的簡便方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清，瑞氏染液，臺(tái)盼藍(lán)染液，印度墨汁，二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，TDL湘儀離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心于2013年10月份提供雌性健康小鼠20只，6～8周齡，體重18～22 g。

1.3 小鼠分離、培養(yǎng)將小鼠頸椎脫臼法處死，用70%酒精消毒小鼠腹部皮膚，然后讓其仰臥位四肢展開，固定于解剖板上，無菌條件下打開小鼠腹腔，用眼科鑷提起下腹皮膚，剪一小口，并沿腹中線剪開3～5 cm長的腹部皮膚，充分暴露腹膜，向腹腔注射預(yù)冷的不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液5 ml，注意進(jìn)針勿過深，不要損傷內(nèi)臟及血管，輕柔腹部約2～3 min，靜置5 min后用鑷子提起腹膜，用吸管吸取腹腔灌洗液，并重復(fù)灌洗一次。將兩次回收的的灌洗液4℃離心，所得細(xì)胞沉淀用預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)液洗滌，1 000 r/min離心10 min兩次，棄去上清，將沉淀細(xì)胞再加入預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)液(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml和10%胎牛血清)重懸細(xì)胞。以常規(guī)方法計(jì)數(shù)細(xì)胞，用預(yù)冷培養(yǎng)液調(diào)整腹腔細(xì)胞濃度至2×106/ml，然后將細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，1 ml/孔，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使巨噬細(xì)胞貼壁。孵育2～4 h后換液，取出培養(yǎng)板，用RPMI1640培養(yǎng)液漂洗1～2次，棄去非粘附的其他細(xì)胞，獲得貼壁細(xì)胞即為單層的巨噬細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液作臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性、并作瑞氏染色。

1.4 巨噬細(xì)胞的觀察與鑒定

1.4.1 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查細(xì)胞培養(yǎng)后每日用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況。

1.4.2 臺(tái)盼藍(lán)染色[3]取巨噬細(xì)胞懸液0.5 ml，滴加等量0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液置于Eppendorf管中，混勻，取一滴染色的細(xì)胞懸液滴加入牛鮑計(jì)數(shù)板中，靜置2～3 min待細(xì)胞下沉后，將計(jì)數(shù)板置顯微鏡下計(jì)數(shù)：在3 min內(nèi)分別計(jì)數(shù)死細(xì)胞、活細(xì)胞，并用活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比表示其活力。

1.4.3 瑞氏染色[4]計(jì)算細(xì)胞純度取細(xì)胞懸液1滴加于潔凈載玻片上，制備涂片，自然干燥，瑞氏染色后將干燥好的涂片置光學(xué)顯微鏡下觀察。先用低倍鏡觀察涂片體尾交界處細(xì)胞薄厚分布及染色情況，再用油鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)5 d(120 h)后行墨汁吞噬試驗(yàn)[5]，在培養(yǎng)體系中加入10%濾紙濾過的優(yōu)質(zhì)印度墨汁50μl繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出蓋玻片，用等滲液洗去游離的墨汁顆粒，晾干，瑞氏染色，油鏡(10× 100倍)下計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞胞漿中吞有大小墨粒5個(gè)以上的為陽性細(xì)胞，計(jì)算吞噬百分率，每張涂片計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)重復(fù)3次取平均值。吞噬百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/200個(gè)吞噬和未吞噬的巨噬細(xì)胞×100%。

2 結(jié)果

2.1 活細(xì)胞形態(tài)觀察培養(yǎng)24 h后用倒置顯微鏡可觀察到貼壁細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形或橢圓形、梭形、不規(guī)則形，細(xì)胞體積較大，胞漿豐富，培養(yǎng)1周時(shí)細(xì)胞表面伸出許多刺毛狀小突起(偽足)。

2.1.1 臺(tái)盼藍(lán)染色正常存活的細(xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，使活細(xì)胞不著色，呈無色透明狀，有折光性。當(dāng)細(xì)胞壞死等造成細(xì)胞膜完整性喪失后，染料彌散進(jìn)入細(xì)胞中將死細(xì)胞染成明顯的藍(lán)色。顯微鏡下可區(qū)分死細(xì)胞、活細(xì)胞，本次實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞的成活率達(dá)98%以上。

2.1.2 瑞氏染色在瑞氏染色下，在油鏡(10× 100倍)下可見細(xì)胞形態(tài)多樣，胞漿豐富，富含顆粒及少許空泡。多為單核，呈卵圓形、腎形或不規(guī)則形，多偏于一側(cè)，著色深，細(xì)胞有突起和偽足，從腹腔分離出來的巨噬細(xì)胞進(jìn)行瑞氏染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的純度＞98%。

2.2 細(xì)胞吞噬功能結(jié)果吞噬了墨汁顆粒的巨噬細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色后胞體呈圓形或不規(guī)則形，胞質(zhì)中有大量大小不等的黑色墨汁顆粒，胞核形態(tài)不規(guī)則并有明顯扭曲折疊。細(xì)胞吞噬試驗(yàn)，顯示巨噬細(xì)胞對(duì)墨汁顆粒有很強(qiáng)的吞噬作用，吞噬百分率為96%。

3 討論

巨噬細(xì)胞屬細(xì)胞免疫，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞能表達(dá)數(shù)十種受體，可產(chǎn)生數(shù)十種酶并能分泌近百種生物活性產(chǎn)物。巨噬細(xì)胞承擔(dān)著吞噬、消除細(xì)胞內(nèi)寄生蟲、真菌和消除衰老的自身細(xì)胞的功能，它在特異性體液免疫和細(xì)胞免疫中都有重要作用，所以巨噬細(xì)胞的吞噬消化功能，在一定程度上可作為衡量機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。由于巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能，檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能對(duì)于判斷巨噬細(xì)胞的功能，了解機(jī)體的特異性和非特異性免疫狀態(tài)有重要作用。巨噬細(xì)胞吞噬功能低下，主要見于原發(fā)性和繼發(fā)性吞噬功能缺陷、胃癌、腸癌等多種腫瘤患者，也可作為考核治療效果及作為判定腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的簡易指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)獲得的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞形態(tài)多樣，胞漿豐富，富含顆粒及少許空泡。多為單核，呈卵圓形、腎形或不規(guī)則形，多偏于一側(cè)，著色深，有突起和偽足，具有體內(nèi)巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征。提取細(xì)胞后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色、瑞氏染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，可獲得高純度＞98%、高活性的巨噬細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞體外吞噬功能主要采用墨汁吞噬實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的吞噬率為96%，說明培養(yǎng)貼壁巨噬細(xì)胞具有良好的吞噬能力。

綜上所述，對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，培養(yǎng)后在短時(shí)間內(nèi)獲得大量貼壁生長細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察，細(xì)胞活力測(cè)定、瑞氏染色、體外吞噬功能檢測(cè)，證實(shí)所培養(yǎng)貼壁細(xì)胞是高純度、高活性的巨噬細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。此種測(cè)定方法操作較為簡便，且重復(fù)性較好，易于獲得足量的巨噬細(xì)胞，是一種快速實(shí)用的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離方法，為巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的簡便方法，可廣泛應(yīng)用于臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

[1]徐遠(yuǎn)義,黃允寧,常越,等.多抗甲素誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)+癌細(xì)胞殺傷增強(qiáng)機(jī)制的研究[J].免疫學(xué)雜志,2006,22(4)∶396-398.

[2]黃瓊,李志,楊杏芬,等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2007,21(2)∶140-146.

[3]黃蓓.細(xì)胞與組織培養(yǎng)[M].北京∶人民衛(wèi)生出版社,1999∶48-49.

[4]鄭天林,彭明婷,谷小林,等.外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)及技巧[D].衛(wèi)生部.2004∶32-33.

[5]謝錦玉.現(xiàn)代細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及其在中西醫(yī)藥中的應(yīng)用[M].北京∶中醫(yī)古籍出版社,1998∶24-26.

[6]高鵬,石磊,張潤玲.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取與鑒定方法探討[J].中國醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2004,5(5)∶400-402.

Separation,cultivation and identification of mouse peritoneal macrophages.

ZHANG Shu-li1,LI Su-fen2.1.Testing Center,Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2. Endemic Disease Research Institute of Shaanxi province,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo establish a convenient method of separation and cultivation of mouse peritoneal macrophages.MethodsAbdominal cavity were douched using RPMI1640 mediun without serum,were isolated and obtained mouse peritoneal macrophages,and the cells were cultured in RPMI1640 mediun with 10%fetal bovine serum.The cells were identified by morphological observation,trypan blue staining,Wright's staining and phagocytosis.ResultsIn this experiment,the obtained were highly purified macrophages with morphologic characteristics Of the macrophage in organism,favourable phagocytosis.ConclusionThis was a simple and pragmatic method for separation and cultivation of mouse peritoneal macrophages.

Mouse;Macrophages;Isolation and cultivation;Identification

R-332

A

1003—6350（2014）19—2814—02

2014-04-26)

西安醫(yī)學(xué)院質(zhì)量工程檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)示范中心（編號(hào)：XYZL2010-18）；西安醫(yī)學(xué)院校級(jí)科研基金大學(xué)生科研項(xiàng)目（編號(hào)：11DXS11）

張淑莉。E-mail：zhangshuli2006@163.com

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2014.19.1109