RAP80在DNA損傷反應中的作用

郝瑋瑋，宋銳鋒，曾引才，徐 峰

(鄭州大學第一附屬醫院消化內科 河南鄭州 450052)

DNA在遭受電離輻射、類輻射性藥物、化學損傷等刺激后會發生DNA雙鏈斷裂(Double-strand break，DSB)，此時 DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)調控激活一系列細胞周期檢查點、DNA修復網絡并促使凋亡反應發生，以確保精確修復損傷位點，維持基因的完整性。許多研究報道，受體相關蛋白80(receptor-associated protein 80，RAP80)在DNA損傷反應中有著重要作用，可促使一系列修復蛋白定位到正確的DNA損傷位點。現對RAP80在DNA損傷反應中的作用綜述如下。

1 RAP80的結構與功能

1.1 RAP80的結構 RAP80定位于人類染色體5q35，基因片段全長超過90 kb，具有15個外顯子及14個內含子，編碼一個含有719個氨基酸，分子質量為79.6 kDa的蛋白。RAP80一級結構的N末端有兩個核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，在 C末端還有第三個NLS，其中N末端第二個NLS對其在細胞核內定位起著關鍵性的作用。激光共聚焦顯微鏡也發現 RAP80主要以斑點型分布于細胞核內［1］。RAP80蛋白羧基端包含兩個鋅指結構，氨基端包含兩個泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motifs，UIM)的核內蛋白。在電離輻射族誘導的損傷中，UIM及204-304氨基酸區是RAP80重新定位所必需的［2］。現已在多種蛋白內發現有UIM結構，其在細胞胞吞、泛素化和 DNA復制、轉錄、修復等方面均有重要作用［3-4］。

1.2 RAP80的功能 2002年，首次克隆分離出RAP80，發現其高表達于睪丸及卵巢，此外在乳腺、心臟等器官也大量表達。酵母雙雜交實驗證實，RAP80可與類固醇激素核受體超家族成員RTR結合，并調節部分發育相關基因的表達［1］。近期又有研究表明RAP80通過依賴激動劑的方式與雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)作用，并可調節 ERα 的轉錄活性［5］。此外還發現，RAP80可與泛素相關小修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier，SUMO)結合酶 UBC9結合而被SUMO化，但SUMO化后的RAP80與DDR信號傳導的作用尚不知曉［6］。目前關于RAP80的研究主要集中于DNA損傷修復定位。

2 RAP80與DNA損傷修復定位

DSB發生時，為確保基因完整性和細胞定位損傷位點，通過周期停滯修復DNA及細胞凋亡，對DNA損傷產生反應。在DNA受到損傷后，一系列DDR相關的蛋白迅速結合，并聚集在細胞核損傷灶周圍，該定位過程涉及多種嚴格控制的翻譯后修飾手段，包括乙酰化、磷酸化、泛素化，SUMOA化等。近來，一種腫瘤抑制基因(也被稱為乳腺癌易患基因)BRCA1在DNA損傷修復、維持基因完整性及細胞的正常發育中所起的作用日益受到重視。而在其作用過程中涉及一系列蛋白，包括 CCDC98/Abraxas，RAP80，MDC1，RNF8 和UBC13等，其中RAP80在損傷后的定位過程中起關鍵作用［7-8］。

以電離輻射導致的損傷灶(ionizing radiation-induced foci，IRIF)為例。DNA損傷后，共濟失調—毛細血管擴張突變基因(ataxia-telangiectasia mutated geng，ATM基因)可快速磷酸化組蛋白 H2A亞型H2AX的C末端，此磷酸化H2AX(即γ-H2AX)在DSBs產生后數秒即開始出現，10 min達到高峰。有研究表明，在H2AXC末端磷酸化位點發生突變時，一系列與調節及修復有關的蛋白無法大量正確定位于IRIF［9］。這說明 γ-H2AX在 DDR相關蛋白定位于IRIF起著重要作用。DNA損傷檢測點介質1(DNA damage checkpoint 1，MDC1)的 C末端區包含兩個BRCA1的 C末端結構區(BRCA1 C-terminal repeat，BRCT)，N末端區包含一個叉狀頭部區(forkhead-associated，FHA)。通過 BRCT結構域，MDC1可與 γ-H2AX的C末端磷酸肽結合，這樣MDC1可以保護γ-H2AX去磷酸化而提高其DNA修復功能;此外，MDC1可通過其FHA結構域與ATM相互作用，從而促使更多的ATM聚集在DSBs周圍，并使H2AX磷酸化，通過該機制可使DNA損傷信號放大［10］。一旦DSB發生，在斷裂處H2AX就會發生磷酸化，形成γ-H2AX。然后MDC1這一適配體蛋白就會直接與γ-H2AX結合，這一步驟是細胞進行修復的關鍵。隨后 RAP80、CCDC98/Abraxas及RNF8發生一系列轉錄后修飾的級聯反應，以促使BRCA1定位到IRIF。有研究表明，RAP80在 DSB發生90～120 min后才重新定位于DNA損傷位點［2］，這說明RAP80是作為DNA損傷反應信號的下游調節者而發揮作用，其具體作用機制如下。

2.1 RAP80結構中的UIM功能 泛素化是一種重要的蛋白質修飾，其通過特異性地降解蛋白質，來調節細胞分化、調控轉錄、參與DNA損傷應答等。UIM不僅可通過調節蛋白單泛素化而影響其活性及功能，并且可通過識別單泛素化及多泛素化序列，而調節蛋白分子內及分子間的相互作用。RAP80氨基端包含兩個UIM，其可直接結合泛素而促進RAP80的多泛素化過程。有研究表明，在電離輻射時缺失UIM的RAP80突變體無法定位于DNA損傷位點［8-9］;UIM基序中重要的氨基酸發生突變，RAP80則無法形成IRIF［11］。這些表明DSB發生時，RAP80及下游相關蛋白是通過RAP80結構中的UIM與泛素化相關蛋白作用，從而在損傷灶重新定位。

2.2 RAP80與細胞周期 RAP80可通過招募形成BRCA1-BARD1-BRCC36復合物定位于IRIF，來調節DNA損傷反應信號的傳導。有研究表明，敲除RAP80表達可提高細胞對IR引起凋亡的敏感性，減少細胞周期檢測點激酶1(checkpoint kinase 1，CHK1)的活性，損傷G2/M期檢查點的調控作用［8-9］。

2.3 RAP80與BRCA1作用 BRCA1是一種重要的DNA損傷應答相關蛋白，它參與了DNA損傷修復過程，特別是在此過程中需要泛素的參與。BRCA1有一個關鍵的C末端結構域BRCT(carboxyl-terminal domain of BRCA1)，該結構域在突變修復過程中發揮著重要作用。BRCT為一個磷酸化肽結合結構域，可以與磷酸化的蛋白質有效結合，特別是對含有pSer-X-XPhe序列的蛋白質結合能力更強。約50%的家族乳腺癌患者和20%～30%的遺傳性卵巢癌患者BRCA1基因發生突變，且大部分突變發生于BCRT結構域［11-12］。有研究發現，乳腺癌及卵巢癌患者BRCT結構域發生突變者BRCA1則無法與RAP80結合，這表明RAP80與BRCA1結合發揮作用需要BRCT結構域的作用。

然而RAP80并不包含可與BRCT結合的pSer-XX-Phe序列，這表明RAP80與BRCA1并不是通過直接結合而發揮作用，而是需要其它BRCT結合蛋白的輔助作用。隨后經研究發現一種新型蛋白CCDC98，可以與BRCA1中的BRCT通過pSer-X-X-Phe而有效結合［13］。重要的是正是這種結合使RAP80被有效招募到BRCA1附近而形成復合體，從而參與對DNA損傷的修復，同時RAP80可以輔助BRCA1在IRIF發生后定位于準確的損傷位點。

BRCA1作為最早發現的乳腺癌抑制基因，它的突變可導致乳腺癌等相關腫瘤發生率明顯升高，而RAP80是作為BRCA1發揮作用時的一個重要伴侶蛋白。低BRCA1、低Rap80水平的患者，其中位生存期顯著延長，這說明Rap80對腫瘤化療效果可能起關鍵性的調節作用［14］。

2.4 RAP80磷酸化 大部分參與IR導致的DNA損傷的蛋白均被ATM磷酸化［15］。RAP80也包含8個潛在的ATM磷酸化位點。已有報到證實其中3個(Ser101，Ser205，Ser402)在體外被 ATM 磷酸化［2，8，16］。但在不同的種屬中，這些磷酸化的位點并非高度保守著。在UV引起的DNA損傷中，RAP80可被ATR磷酸化而發揮作用，這些表明RAP80在不同形式的DNA損傷中及細胞周期調控中均起著重要作用［12］。IR發生5 min后，RAP80即發生磷酸化，這一過程遠遠早于其定位于正確的損傷位點，其早期的磷酸化是否有著特殊的調節功能尚未明了。磷酸化可以影響蛋白之間的相互作用及蛋白的功能，但RAP80的多個磷酸化位點發生突變，并不影響RAP80與BRCA1的定位，據此可認為在IRIF發生時RAP80的定位并不依賴于ATM的磷酸化。因此，在DDR中RAP80的磷酸化可能有著尚未知曉的額外作用。

3 研究展望

由于RAP80在IRIF引起的DNA損傷修復中起著重要作用，因此目前關于其研究多集中于DNA修復及是否可成為新的腫瘤易感基因等方面。研究證實，大約5%～10%的不同類型腫瘤患者血清中含有RAP80抗體，因此可認為RAP80是一種新的腫瘤相關抗原［17］，而關于RAP80的其它功能如泛素化及轉錄等，研究較少。有研究表明在乳腺癌細胞中過量表達RAP80可減少ERα蛋白因泛素化作用而發生的降解，從而提高ERα蛋白水平以及ERα靶基因pS2的轉錄活性［5］。這些說明RAP80可能是ERα的關鍵調節因子，而ERα與多種腫瘤的發生均有密切關系，ERα的活化可促進腫瘤的生長、侵襲及轉移。因此，RAP80很可能通過改變ERα蛋白水平和轉錄活性進而促進其下游基因的轉錄來調控腫瘤的發生和發展。這些為研究RAP80在腫瘤發生中的作用提供了新的方向。而RAP80在腫瘤中所起的作用也有待于進一步的研究。

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