鈣激活鉀通道α亞單位與高血壓關(guān)系的研究

李暢　曾曉榮

[摘要] 了解調(diào)節(jié)血管張力的靶點(diǎn)及內(nèi)源性活性物質(zhì)配體的BKca通道的特性，有助于深入研究通道特性及臨床治療藥物篩選。用脂質(zhì)體（lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BKca表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKca篩選穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞系研究其基本的生理學(xué)特性，同時(shí)建立BKca動(dòng)力學(xué)研究模型。建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BKca通道α亞單位的HEK293細(xì)胞系，通過(guò)膜片鉗記錄到與天然細(xì)胞BKca電生理BKca相似電流，可以用于分析通道動(dòng)力模型及藥物動(dòng)力學(xué)作用機(jī)制。成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BKca通道α亞單位的HEK293細(xì)胞系，膜片鉗實(shí)驗(yàn)證明具有典型的BKca電生理特性，同時(shí)建立細(xì)胞系可以較好的運(yùn)用于BKca通道功能調(diào)控研究和動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析。

[關(guān)鍵詞] 大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；α亞單位；高血壓

[中圖分類(lèi)號(hào)] R544.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）02-47-03

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（Bkca）廣泛分布于哺乳動(dòng)物平滑肌、骨骼肌以及神經(jīng)元上，其中平滑肌上分布最為豐富。Bkca在維持和調(diào)節(jié)平滑肌張力機(jī)制中發(fā)揮重要作用，具有典型的電壓敏感性，與高血壓的發(fā)生發(fā)展以及臨床降壓藥物的治療效果具有密不可分的聯(lián)系。平滑肌上BKca通道包括形成孔道的α和調(diào)節(jié)性β1兩個(gè)膜亞基。BKca通道是目前研究降壓藥物的重點(diǎn)和難點(diǎn)。研究表明α亞單位是BKca的基本功能單位，負(fù)責(zé)BKca通道離子的流動(dòng)，決定BKca的K+選擇性和Ca2+敏感性，從而影響血管的健康狀況。目前已經(jīng)將利用膜片鉗技術(shù)探討B(tài)Kcaα亞單位活性及表達(dá)，作為研究降壓治療藥物的直接依據(jù)。筆者于2012年6月～2013年6月期間通過(guò)脂質(zhì)體（lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BKca表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKca篩選穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞系研究其基本的生理學(xué)特性，同時(shí)建立BKca動(dòng)力學(xué)研究模型了解調(diào)節(jié)血管張力的靶點(diǎn)及內(nèi)源性活性物質(zhì)配體的BKca通道的特性。本文擬就Bkca的分子結(jié)構(gòu)、生理功能，及利用膜片鉗技術(shù)對(duì)BKcaα亞單位的活性及表達(dá)進(jìn)行探討研究，對(duì)鈣激活鉀通道α亞單位與高血壓及降壓藥物療效的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 BKca通道

1.1 BKca通道總論

BKca通道是具有大電導(dǎo)并由Ca2+激活K+通道，是相當(dāng)高的單通道電導(dǎo)（large-conductance，Ca2+-activated K+ channel，BKca通道），早在1981年牛嗜鉻細(xì)胞（chromafin cells）[1]中被發(fā)現(xiàn)，BK通道在不同組織，細(xì)胞和荷爾蒙環(huán)境下有不同的顯性特征，例如在調(diào)節(jié)血管張力，血流量及血壓調(diào)控作用等很多生物學(xué)過(guò)程起著非常重要的作用。大電導(dǎo)Ca2+ 激活的K+通道（BKca）也稱(chēng)為slo或Maxik通道[2]，除了受電壓調(diào)節(jié)外還受胞內(nèi)微摩爾濃度范圍內(nèi)的Ca2+調(diào)節(jié)，去極化時(shí)電導(dǎo)非常大，一般在200ps左右。BKca通道由每個(gè)α亞單位結(jié)合一個(gè)β亞單位之后再形成的BKca通道的四聚體[3]組成。α亞單位質(zhì)量約為125kDa，分別由1200個(gè)氨基酸殘基組成。β1β2β3β4四個(gè)亞基構(gòu)成β亞單位，分別由191，235，257-279，210個(gè)氨基酸殘基組成，質(zhì)量約為22，27.1，29.1-31.6，29kDa.在各種興奮性和非興奮細(xì)胞中都存在有BKca通道，在BKca通道中如果α亞基的不表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致失禁，膀胱過(guò)度興奮，而它的刪除會(huì)影響小腦功能并產(chǎn)生耳聾現(xiàn)象，BKca通道β亞基在平滑肌細(xì)胞中，通過(guò)調(diào)節(jié)興奮-收縮耦聯(lián)參與正常血壓維持的生理過(guò)程，其參與多種疾病的病理過(guò)程，所以目前BKca通道已成為很多重要的藥物作用的靶點(diǎn)。

1.1.1 BKca通道α亞單位分子結(jié)構(gòu)及特性 BKca通道α亞單位分3種（slo1，slo2，slo3），是功能性的結(jié)構(gòu)單位，由一個(gè)鉀通道功能的依賴(lài)電壓激活的核心區(qū)域（S0～S8）及一個(gè)高度保守的同鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的近羧基端的尾區(qū)域（S9～S10），而S0是α亞單位近氨基末端的跨膜片段，其區(qū)別于其他電壓依賴(lài)型通道，對(duì)β亞單位起重要的調(diào)節(jié)作用[4]。

1.1.2 BKca通道β亞單位的分子結(jié)構(gòu)及特性 由兩個(gè)跨膜（transmembrane，TM）單位組成β亞單位，它的多樣性是由位于胞質(zhì)（Cytoplasm）中COOH-末端和NH2-末端決定的，其由一個(gè)大的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)（-loop-）相連，它的重要性在于它與α亞基的結(jié)合能明顯的改變BK通道的各種電性質(zhì)，另外α亞基和β亞基結(jié)合的多種類(lèi)組合是造成原代細(xì)胞中的BK通道電性質(zhì)不確定性的根源，這也是構(gòu)成BKca通道功能多樣性結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。

1.2 BKca通道α亞單位的由來(lái)

1991年在果蠅（Drosophila）slowpoke基因座上了發(fā)現(xiàn)BKca通道的α亞單位。其廣泛表達(dá)于線(xiàn)蟲(chóng)類(lèi)（Caenorhabditis，nematods），昆蟲(chóng)類(lèi)（Drosophia，insects）以及哺乳類(lèi)（mammmls）等多種物質(zhì)中。由于消除了肌肉和神經(jīng)元中Ca2+激活K+通道的電流，所以這些通道又被簡(jiǎn)稱(chēng)為dslo[3]。

1.3 α亞單位組織的分布

BK通道通過(guò)蛋白質(zhì)免疫學(xué)和原位雜交檢測(cè)表明，α、β亞單位在動(dòng)物多種組織細(xì)胞廣泛存在。例如蒼白球、紋狀體等神經(jīng)組織細(xì)胞[5-6]，平滑肌細(xì)胞等肌細(xì)胞[7]，心肌細(xì)胞、以及腎細(xì)胞，胰β細(xì)胞等腺細(xì)胞[8-9]。

1.4 BKca通道α亞基的識(shí)別

目前識(shí)別BKca通道分子的手段主要為免疫印跡[5-10]，免疫組織化及原位雜交等，針對(duì)α抗原決定族的抗體均位于C末端LS8-S9之后的區(qū)域，其中抗體和抗原最為關(guān)鍵。

1.5 α亞基功能結(jié)構(gòu)域及調(diào)控

α亞單位是離子孔道部分，有7個(gè)跨膜片段（S0-S6），連通細(xì)胞外的N端于α亞單位鏈接，而4個(gè)胞內(nèi)疏水片段（S7-S10）和數(shù)個(gè)剪接點(diǎn)通過(guò)細(xì)胞膜內(nèi)的C端連接α亞單位通過(guò)N端連接β。根據(jù)功能α亞單位分為：（1）電壓敏感區(qū)，由S1-S4片段組成，主要感受細(xì)胞膜電位變化。（2）孔道區(qū)，用S5-S6片段組成，主要調(diào)控通道在不同刺激下的通透性。（3）細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，由S7-S10組成，感知多種配體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，而S0是人區(qū)別于其他鈣激活鉀離子通道的結(jié)構(gòu)域，它可以結(jié)合β亞單位的調(diào)節(jié)起重要作用。

1.5.1 K+的選擇性通道 BKca通道的孔道部分位于4個(gè)α亞單位的中心，而每個(gè)α亞單位上分別由S5，S6和P-loop共同組成。離子選擇特異性由六個(gè)保守的氨基酸殘基（TVGYGD）組成的結(jié)構(gòu)域決定，而在第5，6跨膜區(qū)之間的孔道區(qū)間[11]，S6結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為該K+選擇性孔道的關(guān)鍵。根據(jù)MacKinnon的假說(shuō)，BKca通道模擬了K+水合物中氧原子排列的情形，通過(guò)選擇區(qū)氧原子排列讓足夠多的K+進(jìn)入孔道，然后選擇過(guò)的K+又重新被水包裹住。水化后的K+不僅降低靜電排斥力，也使離子重復(fù)進(jìn)行傳導(dǎo)，也為高效率轉(zhuǎn)運(yùn)K+提供了基礎(chǔ)。

1.5.2 BKca通道α亞單位對(duì)Ca2+敏感性 BKca通道α亞單位C末端有一個(gè)由RCK結(jié)構(gòu)域和Ca2+球兩個(gè)可能結(jié)構(gòu)單元決定的通道活性區(qū)域，該區(qū)域現(xiàn)在研究認(rèn)為，參與對(duì)胞質(zhì)Ca2+的依存性[12]。在果蠅和哺乳動(dòng)物的克隆之間表現(xiàn)了最高的序列的保守性，它由N末端的7個(gè)跨膜片段（S0-S6）、S5與S6片段之間的1個(gè)孔區(qū)和胞內(nèi)C末端的4個(gè)疏水片段（S7-S10）組成。疏水跨膜片段S0可與之結(jié)合，其中β亞基調(diào)節(jié)α亞基的功能；C末端區(qū)域包括S7與S8片段，含有K+電導(dǎo)調(diào)節(jié)區(qū)域（RCK），每一個(gè)RCK區(qū)域包含一個(gè)Ca2+結(jié)合點(diǎn)；S9和S10片段之間有著鈣敏感性的結(jié)合點(diǎn)，其稱(chēng)為“鈣池”（calcium bowl）的負(fù)電荷區(qū)域。

2 α亞單位與高血壓的關(guān)系

隨著物質(zhì)生活的不斷改善，高血壓一直以來(lái)困擾著人類(lèi)，它嚴(yán)重威脅人們的健康。目前認(rèn)為高血壓是一種以動(dòng)脈血壓持續(xù)升高為特征“心血管綜合征”。現(xiàn)在血管平滑肌細(xì)胞（vaucular smooth muscle cells ，VSMCs）中至少已確認(rèn)存在4種鉀通道，其通道影響動(dòng)脈的張力及直徑，不僅調(diào)節(jié)VSMCs的膜電勢(shì)（membrane equilibrium potential，Em），也是許多血管活性物質(zhì)的作用靶點(diǎn)。經(jīng)大鼠實(shí)驗(yàn)證明BKca主要調(diào)節(jié)VSMCs舒縮和負(fù)反饋調(diào)節(jié)小動(dòng)脈肌源性緊張等方面，而電壓依賴(lài)性Ca2+通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而引起B(yǎng)Kca通道活性增強(qiáng)。胡志等[13]學(xué)者報(bào)道表明，BKca通道活性增強(qiáng)會(huì)伴隨著VSMCs通道α亞單位表達(dá)增強(qiáng)，通過(guò)熒光染色發(fā)現(xiàn)BKcaα亞單位主要分布在高血壓大鼠VSMCs胞膜上，腸系膜動(dòng)脈電流密度增加，可能與α亞單位表達(dá)及合成增強(qiáng)有關(guān)，也可能與電流密度增加引起血管的舒張[14]，不能抵消平滑肌細(xì)胞肌源性收縮有關(guān)。觀(guān)察BKca與血管平滑肌細(xì)胞周期和增殖內(nèi)在聯(lián)系，可見(jiàn)阻斷或開(kāi)放BKca能調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖，具體的機(jī)制可能與改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。高血壓發(fā)病時(shí)細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生異常，包括Na+、K+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)、鈉泵活性降低，最終導(dǎo)致膜電位降低，Ca2+濃度升高，使血管平滑肌肥大增生、反應(yīng)收縮性增強(qiáng)，增高血管阻力，血壓升高。由此可推斷，降低Ca2+依賴(lài)性進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞，即可降低血管阻力，降低血壓。自發(fā)性高血壓大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，血壓升高可引起電壓依賴(lài)Ca2+通道上調(diào)，檢測(cè)出BKca代償性過(guò)表達(dá)，因此血管平滑肌細(xì)胞膜上電壓依賴(lài)性Ca2+通道對(duì)于促發(fā)血管平滑肌收縮和血管肌源性緊張度密切相關(guān)。

綜上所述，BKca通道是較為廣泛分布在血管平滑肌的細(xì)胞膜上，其電壓敏感性，胞內(nèi)鈣敏感性，大電導(dǎo)特征性決定在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力機(jī)制中起重要作用。對(duì)BKca通道的研究成為目前在臨床降壓用藥的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，很多研究表明α亞單位是BKca的基本功能單位，其負(fù)責(zé)BKca通道離子的流動(dòng)，決定BKca的K+選擇性和Ca2+敏感性，從而影響血管的健康狀況，目前將利用膜片鉗技術(shù)對(duì)BKcaα亞單位的活性及表達(dá)進(jìn)行探討研究，為進(jìn)一步臨床選擇降壓藥物提供直接的依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zhu R，Hu XQ，Xiao D，et al. Chronic hypoxia inhibits pregnancy-induced upregulation of SKCa channel expression and function in uterine arteries[J].Hypertension，2013，62（2）：367-374.

[2] Liu XR，Tan XQ，Yang Y，et al.Propofol increases the Ca2+ sensitivity of BKCa in the cerebral arterial smooth muscle cells of mice[J].Acta Pharmacol Sin，2012，33（1）：19-26.

[3] Goto K，Kansui Y，Oniki H，et al.Upregulation of endothelium-derived hyperpolarizing factor compensates for the loss of nitric oxide in mesenteric arteries of Dahl salt-sensitive hypertensive rats[J].Hypertens Res，2012，35（8）：849-854.

[4] Dumas de la Roque E，Quignard JF，Ducret T，et al. Beneficial effect of dehydroepiandrosterone on pulmonary hypertension in a rodent model of pulmonary hypertension in infants[J].Pediatr Res，2013，74（2）：163-169.

[5] Howitt L，Grayson TH，Morris MJ，et al.Dietary obesity increases NO and inhibits BKCa-mediated， endothelium-dependent dilation in rat cremaster muscle artery：association with caveolins and caveolae[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302（12）：H2464-2476.

[6] Hadchouel J，Soukaseum C，Büsst C，et al. Decreased ENaC expression compensates the increased NCC activity following inactivation of the kidney-specific isoform of WNK1 and prevents hypertension[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（42）：18109-18114.

[7] Hald BO，Jacobsen JC，Braunstein TH，et al. BKCa and KV channels limit conducted vasomotor responses in rat mesenteric terminal arterioles[J].Pflugers Arch，2012，463（2）：279-295.

[8] Howitt L，Sandow SL，Grayson TH，et al. Differential effects of diet-induced obesity on BKCa {beta}1-subunit expression and function in rat skeletal muscle arterioles and small cerebral arteries[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301（1）：H29-40.

[9] Liu R，Zhang Z，Liu H，et al. Human β-defensin 2 is a novel opener of Ca2+-activated potassium channels and induces vasodilation and hypotension in monkeys[J].Hypertension，2013，62（2）：415-425.

[10] Novokhatska T，Tishkin S，Dosenko V，et al.Correction of vascular hypercontractility in spontaneously hypertensive rats using shRNAs-induced delta protein kinase C gene silencing[J].Eur J Pharmacol，2013，718（1-3）：401-407.

[11] Ketsawatsomkron P，Lorca RA，Keen HL，et al. PPARγ regulates resistance vessel tone through a mechanism involving RGS5-mediated control of protein kinase C and BKCa channel activity[J].Circ Res，2012，111（11）：1446-1458.

[12] Yang Y，Li PY，Cheng J，et al. Function of BKCa channels is reduced in human vascular smooth muscle cells from Han Chinese patients with hypertension[J].Hypertension，2013，61（2）：519-525.

[13] 胡志，馬愛(ài)群，田紅燕，等.自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道的活性及表達(dá)改變[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，4（2）：425-426.

[14] 徐春華，戴閔，劉遠(yuǎn)厚.動(dòng)脈粥樣硬化兔血管平滑肌鈣激化鉀通道活性和α亞單位表達(dá)的變化[J].四川醫(yī)學(xué)，2008，7（29）：823-826.

（收稿日期：2013-11-07）