來曲唑在子宮內膜異位癥治療中的作用

龐麗娜

（錦州市婦嬰醫院，遼寧 錦州 121001）

來曲唑在子宮內膜異位癥治療中的作用

龐麗娜

（錦州市婦嬰醫院，遼寧 錦州 121001）

目的 通過觀察芳香化酶抑制劑－來曲唑作用于體外培養的子宮內膜異位癥患者在位內膜細胞（Ectopic endometrial cells of women with endometriosis，EE）后芳香化酶及芳香化酶轉錄刺激因子－類固醇源性因子（SF-1）的表達情況，探討來曲唑作為芳香化酶抑制劑對子宮內膜異位癥（內異癥）的作用。方法 以0、0.1、1、10、100 nmol/L濃度的來曲唑對體外培養的子宮內膜異位癥者的在位內膜細胞（EE）分別進行刺激。72 h后采用RT-PCR法從核酸水平檢測Aromatase和SF-1的mRNA表達情況。結果 不同濃度的來曲唑均可明顯抑制細胞內Aromatasem RNA及SF-1mRNA表達，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.05）；且抑制作用呈濃度依賴性。結論 芳香化酶抑制劑－來曲唑對內異癥在位內膜細胞具有明顯抑制EE細胞內芳香化酶及其轉錄調節因子SF-1的與mRNA表達。

來曲唑；子宮內膜異位癥；芳香化酶

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織來源：EE內膜標本取自2010年8月至2011年8月在錦州市婦嬰醫院婦科，因子宮內膜異位癥巧克力囊腫接受手術的20例患者，年齡在22～44歲；患者均無內科合并癥，月經規律，周期5～7/27～32 d，無其他免疫、代謝性或內分泌性疾病，手術前3個月內未接受雌激素，孕激素或雄激素治療。研究組年齡為（34.9±5.9）歲，對照組年齡為（37.2±6.1）歲，統計學比較無顯著性差異（P＞0.05）。

1.1.2 在位內膜的采集：于月經周期第7～10天取標本，病理檢查證實內膜均為增殖期，內膜采集方法為無菌留取手術切除的子宮內膜或術中刮宮獲得的內膜。所得標本均在手術獲得后0.5 h內置于冰浴的F-12/ DMEM混合培養基（FD）中。24 h以內進行細胞原代培養處理。

1.2 方法

1.2.1 建立細胞模型：①子宮內膜細胞的分離與原代培養：對EM患者的在位子宮內膜（簡稱在位內膜eutopic endometrium EE）細胞進行分離培養，參照Noble等[1]的分離、培養方法，略有改動。②共培養子宮內膜腺上皮及間質細胞鋪滿整個培養瓶底面時，應及時進行傳代、凍存與復蘇。③子宮內膜腺上皮及間質細胞的純度鑒定：上述細胞經倒置顯微鏡觀察：進行腺上皮細胞與間質細胞的形態學差異比較，并攝影；對細胞免疫化學進行鑒定：共培養的間質細胞及腺上皮細胞分別用波形蛋白Vimentin抗體及細胞角化蛋白cytokeratin進行免疫染色，采用不加任何一抗者為陰性對照。

1.2.2 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（Semiquantitative RT-PCR）檢測來曲唑對EE細胞芳香化酶及其轉錄調節因子SF-1mRNA水平的影響：引物設計與合成：從Genebank中檢索芳香化酶（Aromatase）、sF-1及GAPDH的基因序列，結合文獻[2]選取引物序列，引物自身之間及與GAPDH之間不存在互補配對現象。

1.2.3 實驗方法

①將EE細胞以2×105/mL的密度接種于面積為75cm2培養瓶中。置95%空氣，5%CO2，37 ℃溫箱培養；待細胞生長接近鋪滿瓶底時，換用10%FBS培養液繼續培養24 h；24 h后，用0、0.1、1、10、100 nmol/L濃度的來曲唑對體外培養的內異癥患者在位內膜細胞（EE），分別進行刺激。每間隔24 h換液一次，72 h后終止實驗；72 h后，收集細胞，提取細胞總RNA，冷卻后于-70 ℃保存。②進行RNA純度鑒定。③根據cDNA first chain amplification system說明書，建立20 μL的反應體系進行逆轉錄。④確定PCR擴增條件，據此，確定各實驗循環數。⑤PCR擴增。⑥PCR產物的電泳及半定量。

1.2.4 統計學處理：數據經SPSS12.0統計軟件處理，計量資料數據用（）表示，進行t檢驗和方差分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 子宮內膜異位癥患者內膜腺上皮細胞與間質細胞形態學特點

①倒置相差顯微鏡下可發現，間質細胞體積比腺上皮細胞明顯增大，長度變短，呈紡錘狀，核不明顯，細胞與細胞之間呈平行排列；腺上皮細胞輪廓清晰，外形似蝌蚪，核較大而且明顯，細胞間有小絲狀物相互連接，且常圍繞成細胞小團。間質細胞大而不規則。內異癥內膜細胞與非內異癥內膜細胞在形態學特點上差別在于：非內異癥內膜細胞較小，形態規則，排列整齊，具有極性；內異癥內膜細胞較大，形態多不規則，排列紊亂，沒有極性。②內膜腺上皮細胞與間質細胞的免疫細胞化學鑒定。為了進一步鑒定所培養的細胞及其純度，分別用上皮細胞特異的細胞骨架蛋白cytokeratin與間質細胞特異的骨架蛋白vimentin的抗體進行染色。腺上皮細胞cytokeratin染色陽性，而vimentni染色陰性；相反間質細胞eytokeratin陰性，而vimentin染色陽性，結果表明：原代培養的子宮內膜腺上皮細胞中，cytokeratin染色陽性占絕大多數，純度率約90%，間質細胞vimentin染色陽性，純度率達95%以上。

2.2 RT-PCR檢測來曲唑對EE細胞芳香化酶及其轉錄調節因子SF-1 mRNA水平的影響

所有組織標本均檢測到內參照基因GAPDH的穩定表達，證實逆轉錄所得產物cDNA完整性和PCR反應成功。內參照基因GAPDH mRNA的 RT-PCR擴增產物片段長度為576 bp，目的基因Aromatase mRNA的RT-PCR擴增產物片段長度為264 bp，SF-1 mRNA擴增產物片段長度為340 bp。①來曲唑對內異癥在位內膜細胞Aromatase mRNA表達有抑制作用，呈濃度依賴性。見表1。②來曲唑對內異癥在位內膜細胞SF-1 mRNA表達有抑制作用，呈濃度依賴性。見表1。③來曲唑對Aromatase mRNA和SF-1 mRNA的表達不同濃度組間比較，P＜0.05差異有統計學意義。見圖1、圖2。

表1 RT-PCR檢測來曲唑對EE細胞芳香化酶及其轉錄調節因子SF-1 mRNA水平的影響

3 討 論

內異癥患者在位內膜細胞SF-1 mRNA水平異常增高，內異癥在位內膜就具有SF-1的異常表達趨勢。SF-1能與CYP19基因的啟動子Ⅱ結合，啟動細胞轉錄芳香化酶mRNA，進一步表達合成芳香化酶。內異癥患者的內膜細胞能表達SF-1，刺激內膜細胞轉錄與表達芳香化酶，催化內膜細胞合成雌激素，促進內異癥的發生發展。這樣，當有異常表達SF-1趨勢的在位內膜異位到其他組織部位時，其SF-1表達水平進一步增高。SF-1能調節卵巢顆粒細胞的增生與分化，可刺激甾體類酶的表達，在卵巢器官分化形成中起決定作用[3]。促使細胞異常表達芳香化酶，進爾催化合成雌激素，促使局部雌二醇水平增高，子宮內膜細胞增殖、浸潤，促進子宮內膜異位癥的發展以及局部炎癥、免疫反應的發生。因此，我們推測子宮內膜異位癥患者在位內膜芳香化酶、SF-1的高表達可能就是子宮內膜異位癥患者發生內膜異位的根本原因之一。抑制在位內膜芳香化酶、SF-1的高表達可作為治療此疾病的新靶點。

圖1 RT-PCR檢測來曲唑對5組EE細胞芳香化酶mRNA水平的影響

圖2 RT-PCR檢測來曲唑對5組EE細胞芳香化酶轉錄調節因子SF-1 mRNA水平的影響

一般認為，芳香化酶抑制劑治療內異癥的機制：一是通過抑制卵巢和卵巢外組織芳香化酶的活性，降低血清和病灶局部雌激素的濃度；二是降低異位病灶局部芳香化酶的表達。本研究實驗證實芳香化酶抑制劑可以明顯抑制細胞內芳香化酶及其轉錄調節因子SF-1的mRNA表達。進一步支持內異癥發生的“源頭理論”或“在位內膜決定論”。

[1] 譚先杰,劉東遠,郎景和,等.子宮內膜腺上皮及基質細胞分離,培養作為子宮內膜異位癥體外細胞模型的探索[J].現代婦產科進展,2002,11(1):30-32.

[2] 羅輝,呂忠士,史玉霞.芳香化酶在卵巢子宮內膜異位癥中的表達及意義[J].實用醫學雜志,2003,19(11):1222-1223.

[3] 王化麗,于靜,王蓮芬,等.細胞色素芳香酶P450在正常,子宮內膜異位癥子宮內膜的表達及意義[J].實用婦產科雜志,2003,19(2):95-96.

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：1671-8194（2014）08-0107-02