鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA載量與臨床分期的關系研究

楊雀飛，何彪，譚貴海

(高州市人民醫(yī)院檢驗科,廣東 高州525200)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種好發(fā)于鼻咽部頭頸的惡性腫瘤，在我國南方最為常見，其發(fā)病率約為30～50/10萬[1]。有大量研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數鼻咽癌患者癌細胞中均存在EB(Epstein-Barr virus，EBV)病毒，在鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中可以檢測到游離的EB病毒DNA，說明鼻咽癌的發(fā)病與EB病毒感染和發(fā)展有密切關聯(lián)[2，3]。近年應用分子雜交及聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測亦證實EB病毒在鼻咽癌發(fā)展中的重要作用[4，5]。EB病毒DNA載量與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有什么樣的聯(lián)系一直以來是人們所關注和研究的課題之一，本文定量檢測鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA載量，為鼻咽癌患者臨床分期提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2013年1月我院腫瘤科收治住院的87例鼻咽癌患者，全部患者均經病理活檢確診為鼻咽癌。其中男性49例，女性38例；年齡26~82歲，平均年齡54歲。依據92福州分期標準 (1992年在福州召開的全國腫瘤與放射學術會議)進行分期，其中Ⅰ期23例(26.4%)、Ⅱ期 18 例(20.7%)、Ⅲ期 26 例(29.9%)和Ⅳ期20例(23.0%)。

1.2 儀器與試劑 5個由低濃度到高濃度的EB病毒DNA陽性細胞株作為標準品均購買于中南大學腫瘤研究所，實時熒光定量PCR儀為ABI公司產品，PCR相關試劑及淋巴細胞分離液購自中山大學達安基因股份有限公司。

1.3 標本處理 首先，采集87例患者外周血標本2mL存于EDTA-Na2抗凝管中，然后，在無菌的塑料離心管中加入2ml淋巴細胞分離液，將血液進行1:1稀釋后緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細胞分離液的離心管中，1500r/min，15min，進行離心。用長嘴膠頭滴管吸取分離液層中的淋巴細胞(第二層)，把吸取的淋巴細胞溶液裝入另一無菌離心管中加入5ml PBS洗滌，1500r/min,經離心10min后，去掉上層液體，保留離心管底的若干白色物質，即淋巴細胞；再加入等體積Tris-EDTA裂解液和蛋白酶K，37℃水浴1 h，高速離心后取上清，經酚-氯仿抽提，乙醇沉淀清洗得到DNA模板[6]，以 EB病毒DNA為模板進行擴增檢測。

1.4 實驗方法 采用實時熒光定量PCR技術對淋巴細胞中EB病毒游離DNA進行定量測定。反應條件為 93℃ 3min，93℃ 45s， 55℃ 2min， 共 40 個循環(huán)。反應結束后，用計算機將樣本和標準曲線對比，計算出反應體系中待測標本中DNA的拷貝數。PCR反應總體積為50μl，含l0μl PCR緩沖液，引物和對應的熒光標記探針各 10pmol。dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP 各 200 μmol／L，Tap 聚合酶5U，DNA 模板 5μl， 吸取抽提的 DNA 5μl入 PCR的反應管中，在ABI7300自動熒光PCR儀上進行擴增。陽性標準定義為：DNA水平>1×103拷貝/m l判斷為陽性；陰性標準定義為：DNA≤1×103拷貝/ml判斷為陰性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數資料采用χ2檢驗。計量資料采用 x±s表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA檢測 以EB病毒DNA標準品進行定量，計算不同患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA的拷貝數及中位數。結果顯示，鼻咽癌患者淋巴細胞中EB病毒DNA的陽性率為82.76%(72/87)，中位數為7.58×106拷貝數/ml，經 χ2檢驗分析，不同臨床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量測定比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，結果見表1。

2.2 不同分期鼻咽癌患者EB病毒的含量有明顯差異 87例鼻咽癌患者檢測EB病毒DNA載量中，Ⅰ期23例、Ⅱ期18例、Ⅲ期26例、Ⅳ期20例的鼻咽癌患者DNA拷貝數平均數分別為 (4.25±1.14)×103，(4.56±0.68)×104，(7.88±1.65)×105，(8.09±1.65)×106。 對不同組間進行 t檢驗，P<0.05或 P<0.01結果有統(tǒng)計學差異，結果見表2。

表1 不同臨床分期鼻咽癌患者中EB病毒DNA定量測定比較

表2 鼻咽癌患者DNA拷貝數

3 討論

鼻咽癌是一種與EB病毒非常密切的惡性腫瘤，有學者認為在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中，EB病毒感染淋巴細胞是感染及致病的重要機制[7]。而在目前臨床應用廣泛的EB病毒血清標志物檢測指標中，EB病毒DNA定量測定應用對鼻咽癌的診斷及預后的預測有著很大的優(yōu)勢[8，9]。本文資料顯示，采用實時熒光定量PCR法對我院87例鼻咽癌患者外周血淋巴細胞EB病毒DNA含量檢測，結果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者的陽性率為82.76%(72/87)，說明外周血淋巴細胞中EB病毒檢測在鼻咽癌輔助診斷中具有極高價值。然而，有研究分析[10]EB病毒感染鼻咽組織是普遍現(xiàn)象，且感染發(fā)生在癌變前，由于EBV存在F和f兩種亞型，故檢出陽性率不可能達到100%。

鼻咽癌臨床分期指導下的個體化綜合治療已成為腫瘤治療的規(guī)范。鼻咽癌治療療效在一定程度上決定于鼻咽癌所處臨床分期，Ⅰ-Ⅳ期5年生存率分別為92.38%、79.64%、62.31%和40.16%，鼻咽癌的臨床分期在鼻咽癌治療中起重要作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者淋巴細胞中存在大量游離的EB病毒DNA，并發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA隨著腫瘤消長而變化，鼻咽癌患者EB病毒DNA檢測在鼻咽癌治療評價中的重要性已得到普遍認可，然而外周血淋巴細胞中EB病毒DNA在初診鼻咽癌臨床分期中的作用仍不十分清楚。

為進一步明確鼻咽癌患者外周血淋巴細胞中EB病毒DNA鼻咽癌患者臨床分期的關系，本實驗對比分析了鼻咽癌患者EB病毒DNA與所處臨床分期的關系，以明確EB病毒DNA在鼻咽癌臨床分期中的價值。本實驗采用實時熒光定量PCR法檢測EB病毒DNA載量，分析外周血淋巴細胞中EB病毒DNA載量與鼻咽癌患者臨床分期關系。結果顯示EB病毒DNA載量與鼻咽癌臨床分期密切相關，即隨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分期的遞增，EB病毒DNA拷貝數越高，這與相關報道相同[12]。Ⅲ、Ⅳ期EB病毒DNA拷貝數明顯高于Ⅰ、Ⅱ期的，即臨床分期越晚，患者淋巴細胞中EB病毒DNA載量越高,外周血淋巴細胞中EB病毒游離DNA拷貝數與鼻咽癌分期相一致，很好地反映了鼻咽癌臨床特征，EB游離DNA拷貝數與患者體內腫瘤負荷呈正相關，提示EB病毒DNA載量與鼻咽癌病情進展密切相關，可作為病情監(jiān)測及判斷療效的一種有效手段。

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