高效液相色譜法測定異喹啉類H-4含量及其有關物質

徐超+楊建云+肖炳坤+黃榮清

[摘 要] 目的：建立高效液相色譜法測定H-4的含量及其有關物質檢查的方法。方法：采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相為甲醇-水，線性梯度洗脫（0-25min 35%甲醇→75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇→35%甲醇）；檢測波長為236nm，流速1mL/min，柱溫40℃；進樣體積20μL。結果：有關物質與主峰分離良好，在20～400μg/mL （r=0.9990）線性范圍內良好，檢測限為0.8ng。結論：本法簡單、快速、靈敏、準確，可用于H-4的質量控制。

[關鍵詞] 含量測定；高效液相色譜法

中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）01-069-03

Doi：10.11876/mimt201401018

HPLC Determination of Content of Isoquinoline H-4 and its Related Substances

XU Chao1.2， YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2

（1.Jiangxi university of TCM，Nanchang 330004；2.Academy of military medicine science，Peking 100850）

[Abstract] Objective： To establish a method for the determination of the content of H-4 and its related substances. Methods：RP-HPLC method was established. Column： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈ （250mm×4.6mm，5μm）；Mobile phase： water-methanol， Linear gradient elution， at a flow rate of 1mL/min with a diode array detector set at 236 nm； the temperature of column is 40℃.Results： Good linearity of the H-4 curve range of 20μg/mL～400μg/mL （r=0.9990）.The limited of detection is 0.8ng.Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive and convenient which can be used to control the quality of H-4.

[Key words] Determination of content； HPLC

1 概述

近年來，環境污染、快節奏的生活規律已讓癌癥的發病率越來越高，目前已成為世界性的難題。臨床上治療癌癥的方法有化療、放療、手術，免疫療法和其他方法 [1]。H-4是新型研發的異喹啉抗腫瘤藥物，為組蛋白去乙酰化酶抑制劑，能引起細胞周期阻斷和細胞凋亡基因的激活，從而抑制腫瘤細胞的生長[2]。本文采用高效液相色譜法對H-4及其在合成中產生的有關物質進行檢測，結果表明，該法靈敏度、精密度和重現性均能滿足要求，實驗數據準確可靠。

2 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀（waters2695泵，2 9 9 6型二極管陣列檢測器，自動進樣器，EMPOWER數據處理系統）；BP211D型電子天平（德國SARTORIUS）；甲醇、乙腈為色譜純（FISHER生產商），水為純凈水（娃哈哈有限公司）；H-4對照品（純度99.6%），原料藥（批號20120715，20120716，20120717）均由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供。

3 實驗部分

3.1 對照品溶液的制備

取對照品H-4 12mg，精密稱量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得對照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取供試品12mg，精密稱量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。

3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱：流動相為甲醇-水，線性梯度洗脫（0-25min 35%甲醇→75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇→35%甲醇），檢測波長為236nm；流速1.0mL/min；柱溫40℃，進樣體積20μL。在該色譜條件下，理論塔板數大于10000，分離度大于1.5，色譜行為良好（如圖1）。

4 方法學考察

4.1 線性關系

取對照品約10mg，精密稱定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密取對照品貯備液0.5 mL，1.0mL，2.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度的溶液。取上述溶液及貯備液20μL，按“3.3”色譜條件下分別進樣兩次，記錄色譜圖。以對照品進樣濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，以對照品峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，得線性方程：Y=109261X+899070，r=0.9990（n=7），結果表明H-4在 20μg/mL～400μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

4.2 檢測限與定量限的確定

以信噪比3：1時注入儀器的量為檢測限，以信噪比約為10：1時注入儀器的量為定量限。結果H-4的檢測限為0.8ng，定量限為3.2ng。

4.3 精密度試驗

取3.1項下得對照品溶液，連續吸取6次，每次20μL，以峰面積計算其RSD為0.50%（n=6）。結果表明測定是儀器精密度良好。

4.4 重復性試驗

分別精密稱取樣品（批號20120717）9份，按3.2項下方法操作，配制成濃度為100μg/mL，120μg/mL，150μg/mL的低中高三個濃度，每個濃度溶液制備3份，按3.3色譜條件下測定H-4的含量，平均含量為99.4%，RSD為0.87%（n=9），表明該方法重復性良好。

4.5 穩定性實驗

取4.4項下配制好的高、中、低3個濃度的供試品溶液，在0，4，8，12，24，48，72h分別進樣20μL，測定峰面積，計算高、中、低三個濃度的峰面積的RSD分別為1.45%、1.21%及0.93%。表明供試品溶液在室溫放置72h內穩定性良好。

4.6 樣品含量測定

按3.1，3.2項下的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液，分別進樣20μL，按外標法以峰面積計算樣品含量。實驗數據如表1，3批樣品H-4含量均在99.0%以上。

4.7 有關物質含量測定

取3.2項下的供試品溶液1mL，精密量取，置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得自身對照溶液。以3.2項下配置的溶液為供試品溶液，按不加校正因子主成分自身對照法計算有關物質的含量。結果表明，有關物質均在1%以內（見表1）。

5 討論

5.1 流動相溶劑的優化

流動相是改善分離度的重要參數，分別考察甲醇—水、乙腈—水以及混合溶劑（甲醇乙腈）—水三種流動相對樣品的分離。試驗表明乙腈—水系統主峰與有關物質峰分離度小于1.5。而混合溶劑（甲醇乙腈）—水則表現出理論塔板數低的缺點。所以最終選擇甲醇—水系統。在該流動相系統條件下能較好的改善峰型，且分離度大于1.5，理論塔板數大于10000。

5.2 波長的選擇

H-4溶解在甲醇中最大吸收波長為236nm，有關物質也在此波長處有較強吸收；且在此波長處溶劑無干擾，故選擇236nm波長為檢測波長。

5.3 色譜柱的考察

選擇了不同填料、規格及廠家的色譜柱進行比較，包括Phenomenex LUNA C₁₈ Column（250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C₁₈ Column（250mm×4.6mm，5μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈ （250mm×4.6mm，5μm）。結果表明Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈最佳，所得色譜圖分離度良好，柱效高，而且相對于其他兩類色譜柱，保留時間也有一定的提前。

6 結論

綜上所述，該法靈敏度高，重復性好，專屬性強，可為H-4樣品的質量標準提供可靠的依據。

參 考 文 獻

[1] Chi-che Chang， Wei-chuan Chen， Development of natural anti-tumor drugs by microorganisms[J]， Journal of Bioscience and Bioengineering， 2011， 111（5）：501–511.

[2] 譚玉梅，黃文淵.組蛋白去乙酰化酶抑制劑研究[J]，進展藥學學報，2009， 44 （10）： 1072？1083.