選擇性一維反式氫磷相關技術及在含磷化學毒劑分析中的應用

鐘近藝+鄭禾+崔燕

[摘 要] 采用整形脈沖和選擇性激發技術，設計了一維磷選擇性氫磷異核單量子相干（1H-31PHSQC）及多量子相干（1H-31PHMQC）脈沖序列，并以此為基礎建立了相應檢測方法。研究結果表明，選擇性一維1H-31PHMQC技術比1H-31PHSQC靈敏度更高，可用于逐一分析和指認環境基質中的含磷化學毒劑。

[關鍵詞] 氫磷相關；核磁共振；化學位移；耦合常數；化學毒劑

中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）01-009-04

Doi：10.11876/mimt201401003

The Application of Phosphorus-Selective 1H-31P Heteronuclear Coherence Technique on Detection of Organophosphorous Chemical Warfare Agents ZHONG Jin-yi1，2， ZHENG He2， CUI Yan2. （1.State Key Laboratory of NBC Protection For Civilian， Beijing 102205；2.Research Institute of Chemical Defence， Beijing 102205）

[Abstract] Introducing shaping pulses and selective excitation techniques， the Phosphorus-selective one-dimensional 1H-31P HSQC and HMQC were applied respectively to experiments. Compared to 1H-31P HSQC， application of the 1H-31P HMQC method resulted in more sensitive， and it is an effective technique for screening and identification of organophosphorus chemical warfare agents in environmental samples.

[Key words] 1H-31P heteronuclear multiple quantum coherence； NMR； Chemical shift； Coupling constant； Chemical warfare agent

引 言

在諸多的核磁共振技術中，選擇性激發技術主要用于溶劑峰壓制和核磁共振譜峰的精細結構研究[1]，但隨著分析需求的不斷提高，選擇性激發技術在混合物分析中嶄露頭角[2-3]，特別是在結構相近化合物的分析中發揮了越來越重要的作用[4-5]，在化學毒劑的分析中也是如此[6]，神經性含磷化學毒劑由于其速殺性，一直是《禁止化學武器公約》監控的重點，但該類化合物在環境中易降解，因此降解產物也是核查的關鍵證據，但降解產物由于結構相近，氫譜譜峰之間重疊嚴重，僅用磷譜也難以區分。從結構上看，大多數神經性含磷化學毒劑的通式為：

其中，R1不僅是構成化學毒劑的關鍵元素，而且R1都具有共同的結構特征，即R1上與磷直接相連的氫核（或烷基氫/烷胺基氫）均與磷核發生耦合，雖然相隔兩個化學鍵，耦合常數仍介于10～22Hz之間。環境基質的含磷背景干擾非常少，磷譜較為干凈，即使存在含磷化合物的干擾，由于磷譜的化學位移范圍較寬、譜線分辨率較好，一般不會出現譜峰之間的重疊，我們以此為選擇性激發實驗的突破口，通過磷磁化矢量的選擇，建立磷選擇性氫磷相關方法，以獲取含磷化合物上磷氫核之間的連接關系，設計和實現了磷選擇性一維反式氫磷相關脈沖序列，并首次成功將該技術用于水樣中含磷化學毒劑降解產物的混合物分析中，解決了多種含磷化合物的逐一指認問題。

1 實驗部分

1.1 樣品制備

W0樣品為含有4種有機烷基膦酸的水樣，依次為甲基膦酸（MPA），乙基膦酸（EPA），丙基膦酸（PPA），異丙基膦酸（iPPA），這4種含磷化合物均為神經性毒劑的降解產物。濃度分別為380μg/ mL、362μg/mL、226μg/mL和312μg/mL。結構如圖1所示。取0.5mLW0樣品，用0.15mL重水（D2O）鎖場。

圖1 四種烷基膦酸結構

1.2 儀器與試劑

譜儀：Varian NMR System 600M核磁共振波譜儀，AutoXBB探頭，1H共振頻率為599.778MHz，31P的共振頻率為240.0MHz，測試溫度為298K，1H和31P的化學位移分別以DSS和H3PO4（85%）為外標。

試劑：實驗中所用的氘代試劑均為美國CIL公司產品，氘代率不小于99.8%。1.3 實驗參數

1H譜：脈沖序列為s2pul，45°激發脈沖角采集，譜寬6kHz，采樣時間2.0s，弛豫延遲時間1s，譜圖用指數窗函數進行加權（lb=1.0Hz）。

31P{1H}NMR譜：脈沖序列為s2pul，45°激發脈沖角采集，譜寬30kHz，弛豫延遲1s，采樣時間2.0s，采用WALTZ組合脈沖進行質子去耦，譜圖用指數窗函數進行加權（lb=1.0Hz）。

磷選擇性一維1H-31PHSQC和1H-31PHMQC譜：均使用整形31P脈沖，偏置和帶寬與所需選擇性激發的磷峰相匹配，選擇高斯整形脈沖。耦合常數JHP為 24Hz，延遲為梯度脈沖時間（1ms）和梯度恢復延遲時間（100μs）的總和，HSQC用于相干選擇的梯度強度（g1，g2）為44.8和17.9g/cm，HMQC用于相干選擇的梯度強度（g1，g2，g3）分別為28、12、0g/ cm，采樣時間和弛豫延遲為1.0和2.0s，譜圖在傅立葉變化前進行加權（lb=1.0）。

2 結果與討論

2.1 選擇性脈沖的實現

選擇性激發主要是通過整形脈沖來實現。從傅立葉變換的角度考慮，由于整形脈沖和矩形脈沖的時域信號不同，經傅立葉變換后產生不同的頻域圖，即激發的頻譜寬度不同，當選定一定形狀的整形脈沖，并選定這種整形脈沖的寬度，即可確定所激發頻譜的寬度，通過調整偏置來對準所選磷譜位置，最終實現對磷譜的選擇性激發。

2.2 脈沖序列的實現

在脈沖序列的實現上，用選擇性脈沖替代特定頻率或區域的硬脈沖，固定延遲取代演化時間t1。選擇性脈沖可分為180°脈沖和90°脈沖，對于給定的場強來說，選擇性180°脈沖的選擇性較相應的90°脈沖好，但可用于選擇性激發的范圍大大減少，我們通過對HSQC中的180°脈沖進行翻轉，對HMQC中的90°脈沖進行選擇性激發，設計了兩種選擇性激發脈沖序列，如圖1和圖2所示。為了減少31P選擇性脈沖之后J耦合的演化，在選擇性脈沖后不設梯度，以便選取180°質子脈沖以前的異核零量子相干以及此脈沖之后的雙量子相干。按此方式，溶劑質子的磁化量被有效去相，只有與所選31P鍵直接相連的質子信號被保留。為了獲取同相的多重峰，在最后的31P選擇性脈沖后插入一個延遲。出于靈敏度的考慮，省略了延遲。

2.3 選擇性一維反式氫磷相關脈沖序列測定W0的結果

圖4是W0樣品的氫譜，四種毒劑相關化合物的1H化學位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化學位移1.31ppm的雙峰為典型的甲基峰，從耦合常數上（17.4Hz）可以進一步確認其歸屬為甲基膦酸的甲基峰，由于4種化合物是以混合物形式存在，無法從積分面積獲取質子間比例的信息，化學位移在1.80、1.58、1.48ppm的譜峰均顯示AB體系裂分模式，這是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm處的雙二重峰可以直接指認為異丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于樣品無背景干擾，我們可以采用同核相關技術（gCOSY）進行質子的歸屬，如圖5所示，可以首先從1.00ppm和1.80ppm的相關確認異丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相關、1.44ppm和1.58ppm的相關可以將這些質子明確指認為丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同樣可以確定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四種結構類似的烷基膦酸的磷譜見圖6，四種有機磷化合物的化學位移分別為26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，僅憑化學位移無法確定四個磷譜峰的歸屬。圖7是磷選擇性一維1H-31P HSQC譜，從譜中可以看到，四種化合物的氫譜被一一分開，直接可以完成化合物的指認，多重峰的譜線強度比有些偏差，但是很容易獲取譜峰的多重性和耦合強度信息。

參 考 文 獻

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.

2 結果與討論

2.1 選擇性脈沖的實現

選擇性激發主要是通過整形脈沖來實現。從傅立葉變換的角度考慮，由于整形脈沖和矩形脈沖的時域信號不同，經傅立葉變換后產生不同的頻域圖，即激發的頻譜寬度不同，當選定一定形狀的整形脈沖，并選定這種整形脈沖的寬度，即可確定所激發頻譜的寬度，通過調整偏置來對準所選磷譜位置，最終實現對磷譜的選擇性激發。

2.2 脈沖序列的實現

在脈沖序列的實現上，用選擇性脈沖替代特定頻率或區域的硬脈沖，固定延遲取代演化時間t1。選擇性脈沖可分為180°脈沖和90°脈沖，對于給定的場強來說，選擇性180°脈沖的選擇性較相應的90°脈沖好，但可用于選擇性激發的范圍大大減少，我們通過對HSQC中的180°脈沖進行翻轉，對HMQC中的90°脈沖進行選擇性激發，設計了兩種選擇性激發脈沖序列，如圖1和圖2所示。為了減少31P選擇性脈沖之后J耦合的演化，在選擇性脈沖后不設梯度，以便選取180°質子脈沖以前的異核零量子相干以及此脈沖之后的雙量子相干。按此方式，溶劑質子的磁化量被有效去相，只有與所選31P鍵直接相連的質子信號被保留。為了獲取同相的多重峰，在最后的31P選擇性脈沖后插入一個延遲。出于靈敏度的考慮，省略了延遲。

2.3 選擇性一維反式氫磷相關脈沖序列測定W0的結果

圖4是W0樣品的氫譜，四種毒劑相關化合物的1H化學位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化學位移1.31ppm的雙峰為典型的甲基峰，從耦合常數上（17.4Hz）可以進一步確認其歸屬為甲基膦酸的甲基峰，由于4種化合物是以混合物形式存在，無法從積分面積獲取質子間比例的信息，化學位移在1.80、1.58、1.48ppm的譜峰均顯示AB體系裂分模式，這是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm處的雙二重峰可以直接指認為異丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于樣品無背景干擾，我們可以采用同核相關技術（gCOSY）進行質子的歸屬，如圖5所示，可以首先從1.00ppm和1.80ppm的相關確認異丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相關、1.44ppm和1.58ppm的相關可以將這些質子明確指認為丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同樣可以確定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四種結構類似的烷基膦酸的磷譜見圖6，四種有機磷化合物的化學位移分別為26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，僅憑化學位移無法確定四個磷譜峰的歸屬。圖7是磷選擇性一維1H-31P HSQC譜，從譜中可以看到，四種化合物的氫譜被一一分開，直接可以完成化合物的指認，多重峰的譜線強度比有些偏差，但是很容易獲取譜峰的多重性和耦合強度信息。

參 考 文 獻

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.

2 結果與討論

2.1 選擇性脈沖的實現

選擇性激發主要是通過整形脈沖來實現。從傅立葉變換的角度考慮，由于整形脈沖和矩形脈沖的時域信號不同，經傅立葉變換后產生不同的頻域圖，即激發的頻譜寬度不同，當選定一定形狀的整形脈沖，并選定這種整形脈沖的寬度，即可確定所激發頻譜的寬度，通過調整偏置來對準所選磷譜位置，最終實現對磷譜的選擇性激發。

2.2 脈沖序列的實現

在脈沖序列的實現上，用選擇性脈沖替代特定頻率或區域的硬脈沖，固定延遲取代演化時間t1。選擇性脈沖可分為180°脈沖和90°脈沖，對于給定的場強來說，選擇性180°脈沖的選擇性較相應的90°脈沖好，但可用于選擇性激發的范圍大大減少，我們通過對HSQC中的180°脈沖進行翻轉，對HMQC中的90°脈沖進行選擇性激發，設計了兩種選擇性激發脈沖序列，如圖1和圖2所示。為了減少31P選擇性脈沖之后J耦合的演化，在選擇性脈沖后不設梯度，以便選取180°質子脈沖以前的異核零量子相干以及此脈沖之后的雙量子相干。按此方式，溶劑質子的磁化量被有效去相，只有與所選31P鍵直接相連的質子信號被保留。為了獲取同相的多重峰，在最后的31P選擇性脈沖后插入一個延遲。出于靈敏度的考慮，省略了延遲。

2.3 選擇性一維反式氫磷相關脈沖序列測定W0的結果

圖4是W0樣品的氫譜，四種毒劑相關化合物的1H化學位移主要集中于0.8-1.9ppm，其中，化學位移1.31ppm的雙峰為典型的甲基峰，從耦合常數上（17.4Hz）可以進一步確認其歸屬為甲基膦酸的甲基峰，由于4種化合物是以混合物形式存在，無法從積分面積獲取質子間比例的信息，化學位移在1.80、1.58、1.48ppm的譜峰均顯示AB體系裂分模式，這是由于其中的手性磷原子造成的，1.00ppm處的雙二重峰可以直接指認為異丙基膦酸的Hb，0.90ppm的三重峰是丙基膦酸的Hc。

由于樣品無背景干擾，我們可以采用同核相關技術（gCOSY）進行質子的歸屬，如圖5所示，可以首先從1.00ppm和1.80ppm的相關確認異丙基膦酸的Ha（1.00ppm）和Hb（1.80ppm）；由0.84ppm和1.44ppm的相關、1.44ppm和1.58ppm的相關可以將這些質子明確指認為丙基膦酸的Ha（1.58ppm）、Hb（1.44ppm）、Hc（0.90ppm）。同樣可以確定乙基膦酸的Ha（1.58ppm）和Hb（0.98ppm）。四種結構類似的烷基膦酸的磷譜見圖6，四種有機磷化合物的化學位移分別為26.4ppm、28.9ppm、30.2ppm和 32.8ppm，僅憑化學位移無法確定四個磷譜峰的歸屬。圖7是磷選擇性一維1H-31P HSQC譜，從譜中可以看到，四種化合物的氫譜被一一分開，直接可以完成化合物的指認，多重峰的譜線強度比有些偏差，但是很容易獲取譜峰的多重性和耦合強度信息。

參 考 文 獻

[1] Duddeck H， Dietrich W， Toth G. Structure Elucidation by Modern NMR[M]. 1998.

[2] Nolis P， Gil S， Espinosa JF， et al. Improved NMR methods for the direct 13C-satellite-selective excitation in overlapped 1H-NMR spectra[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（2）： 121-132.

[3] Todica M， Fechete R， Blumich B. Selective NMR excitation in strongly inhomogeneous magnetic fields[J]. J Magn Reson Imagin， 2003， 164（2）： 220-227.

[4] Ghiviriga I. Selective excitation 1D-NMR for the assignment of the absolute configuration of secondary alcohols[J]. J Org Chem， 2012， 77（8）： 3978-3985.

[5] Rastrelli F， Schievano E， Bagno A， et al. NMR quantification of trace components in complex matrices by band-selective excitation with adiabatic pulses[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47（10）： 868-872.

[6] Koskela H， Ullastiina H， Paula V. Structural characterization of chemical warfare agent degradation products in decontamination solutions with proton bandselective （1）H-（31）P NMR spectroscopy[J]. Anal Chem， 2010， 82（12）： 5331-5340.