老年肺結核患者外周血NKG2A、NKG2D表達及相關分析

魏 蘭,李 輝

結核病是威脅人類健康的重要傳染病之一,其發病率及死亡高峰逐漸移向老年人[1]。結核病中以肺結核最為多見。近年來研究發現,肺結核的發病和轉歸與機體的免疫狀態相關,主要是細胞免疫功能。自然殺傷細胞(natural killer,NK)是細胞免疫系統的第一道防線,而NK細胞的有效活化依賴其活化和抑制信號之間的動態平衡。NKG2A、NKG2D分別是NK細胞表面主要的抑制性受體和活化性受體之一,正常情況下,兩種受體表達趨于平衡。本研究將NKG2A、NKG2D表達水平的變化作為檢測指標,旨在探討NKG2A、NKG2D表達水平變化對老年肺結核患者免疫功能狀態的影響,并為肺結核免疫治療提供新思路和理論依據。

1 對象與方法

1.1研究對象 共入選初治肺結核100例,其中男53例,女47例,年齡60～81歲,平均70.5歲。病例來源于我院2012年5月～2013年5月的住院患者,未經抗癆治療或治療未超過1月,以防止治療對結果的干擾。根據痰檢結果分為:(1)初治菌陰肺結核組:55例,符合中華醫學會結核病學會制定的《肺結核診斷和指南》中“菌陰肺結核診斷”[2]標準；(2)初治菌陽肺結核組:45例,符合國家傳染肺結核診斷標準。根據是否合并肺外結核分為:(1)無肺外結核組:48例；(2)合并肺外結核組:52例(其中淋巴結核20例,結核性胸腔積液15例,胸壁結核10例,結核性腹腔積液7例)。根據肺部病灶受累程度分為:1～2個肺野組46例,3～4個肺野組40例,5～6個肺野組14例。根據有無空洞分為有空洞組(52例)及無空洞組(48例)。以同期我院健康體檢者89名為對照,男49名,女40名；年齡60～85歲,平均72.5歲。

1.2試劑與儀器 NKG2A-PE、NKG2D-PE(R&D公司),CD3- PE-Cy5、CD56-FITC試劑盒(eBioscience公司),PBS稀釋液、牛血清白蛋白、淋巴細胞分離液(海澳生物工程公司)；FACS Calibur 型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3方法 抽取所有對象清晨空腹上肢靜脈血2 ml,EDTA抗凝,6 h內處理,并將抗凝血2 ml與等體積的PBS緩沖液混勻,緩慢注入淋巴細胞分離液液面之上,分離單個核細胞,PBS洗滌,將細胞懸液1200 r/min離心5 min,棄上清,用 PBS 100 μl重懸細胞。檢測NKG2A時,管中加入CD56-FITC、NKG2A-PE和CD3-PE-Cy5各10 μl；檢測NKG2D時,管中加入CD56-FITC、NKG2D-PE和CD3-PE-Cy5各10 μl,4 ℃孵育30 min,同時設陰性對照。1000 r/min離心10 min,棄上清,PBS沖洗2次,除去未結合的抗體。轉移至流式管,加入適量PBS緩沖液待測。用流式細胞儀測定NK細胞表面受體。實驗結果用Expo 32 ADC軟件進行分析,得到熒光標記陽性細胞的百分數。

2 結果

結核組與體檢組相比,外周血NK細胞表面受體NKG2D表達明顯降低,NKG2A的表達明顯上調(P<0.05,表1)。

表1 結核組與體檢組NKG2A與NKG2D表達率的差異(%)

單純肺結核組與肺結核合并肺外結核組相比,肺結核合并肺外結核的NKG2A表達增高(P<0.05)。根據肺部病灶受累程度分為:1～2個肺野組、3～4個肺野組、5～6個肺野組。結果顯示,各組間NKG2D表達率差異有統計學意義(P<0.05),NKG2D表達隨著病灶受累范圍增加而降低。菌陰肺結核組與菌陽肺結核組、空洞組與無空洞組相比,NKG2D、 NKG2A表達均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 老年初治肺結核患者不同組別NKG2A與NKG2D表達率的變化(%)

3 討論

NK細胞既是重要的自然防御細胞,又是體內多種免疫細胞尤其是T淋巴細胞的調節細胞。肺結核患者NK細胞活性降低早有報道,如Yildiz等[3]、Leung等[4]均報道肺結核患者與健康人對比,NK細胞顯著下降。翟慧等[5]報道,肺結核患者與非肺結核患者相比,NK細胞明顯降低。NK細胞的功能狀態主要由其表面活化性受體(NKG2D)及抑制性受體(NKG2A)的平衡狀態決定。二者特異性識別相應配體,分別轉導活化或抑制信號,協同作用調節NK細胞活性。因NK細胞表達CD56,不表達CD3,而NKT細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子,本研究為避免NKT細胞的干擾,將分析區域設定為CD56+CD3-的細胞群設門(即對細胞群進行分析)。

結核組與體檢組相比,外周血NK細胞表面活化性受體NKG2D表達下降,而抑制性受體NKG2A表達上調,提示NK細胞殺傷活性受到抑制。李軍等[6]研究顯示,在結核桿菌耐熱抗原的刺激下,第12 d出現NK細胞及T細胞表面NKG2A表達量升高,與本研究結果一致；NKG2D無顯著變化,與本研究結果不相符。同時已有研究表明,在結核桿菌耐熱抗原刺激初期12 h之后,NK細胞活化,進一步刺激γδT細胞增殖[7]。而增殖的γδT細胞對結核桿菌有很強的殺傷作用,這種作用依賴于NK細胞的活化[8]。

結核菌侵入機體后,機體抵抗力較強時,不發生肺結核或僅為隱性感染,但結核菌仍在體內存活、繁殖,并播散至其他部位。機體免疫力降低時,轉變為顯性感染,形成相應部位的結核,即肺外結核。本研究結果表明,合并肺外結核組與單純肺結核組相比,外周血NK細胞表面抑制性受體(NKG2A)表達量升高,活化性受體無明顯變化,提示合并肺外結核患者NK細胞殺傷活性明顯降低,機體免疫功能降低。付笑迎等[9]研究顯示,與健康人外周血NK細胞相比,結核性胸腔積液中的NK細胞降低,NKG2D和NKG2A表達均明顯增加。提示在結核局部免疫狀態中,NK細胞處于活化狀態,發揮其殺傷作用。NK細胞受體表達在局部免疫狀態與全身免疫狀態的不同,有待于進一步研究。

本研究根據肺結核患者肺部病灶受累程度分為1～2個肺野組、3～4個肺野組、5～6個肺野組。結果顯示,NKG2D表達率在3組間有統計學差異,且隨著病變累及范圍的增加而降低。而NKG2D作為活化性受體,其表達率降低可減弱NK細胞對病原菌的殺傷作用,使結核桿菌更易發生免疫逃逸,從而進一步加重病情,與翟慧等[5]研究結果相一致。

本研究發現,菌陽肺結核與菌陰肺結核、肺結核空洞組與無空洞組相比,NKG2A、NKG2D表達差異無統計學意義。目前國內外尚無相關報道,此觀點有待今后研究進一步探討。

綜上所述,隨著老年肺結核患者病情進展,機體免疫功能降低,陷入惡性循環。檢測老年肺結核患者外周血NKG2A、NKG2D的表達變化,對了解患者機體免疫功能的狀態、病情估計有一定臨床價值,可為免疫治療提供重要的理論依據。

【參考文獻】

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[2] 中華醫學會結核學分會.肺結核診斷及治療指南[J].中華結核和呼吸雜志,2001,24(2):71-74.

[3] Yildiz P,Kadakai F.Natural killer cell activity in multidrug resistant pulmonary tuberculosis[J].Respiration,2001,68(6):590-594.

[4] Leung WL,Law KL,Leung VS,et al.Comparison of intracellular cytokine flow cytometry and an enzyme immunoassay for evaluation of cellular immune response to active tuberculosis[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(3):344-351.

[5] 翟慧,劉一典,唐神結,等.肺結核患者外周血NKT細胞、NK細胞、T淋巴細胞亞群的變化及意義[J].同濟大學學報,2010,31(5):42-46.

[6] 李軍,魏海明,張瑞軍,等.結核桿菌耐熱抗原對人外周血淋巴細胞NKG2A、NKG2D的影響[J].中國免疫學雜志,2005,21(8):571-574.

[7] Rui-Jun Zhang,Hai-Ming Wei,Bai-Qing Li,et al.Human natural killer cells positively regulate γδT cells in response toMycobacteriumtuberculosis[J].Faseb J,2003,17(7)：C308.

[8] 高學平,宋秀宇,陳勇,等.結核桿菌低分子多肽抗原誘導活化的γδT細胞的細胞毒活性研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2000,16(5):391-393.

[9] 付笑迎,李麗,李琴,等.胸液中NK 細胞的亞群及表型功能特征分析[J].免疫學雜志,2012,28(8):691-694.