兩種取材方法體外培養結膜細胞的實驗比較

陳 康,蔡曉峰,李旭清,秦 馳,庹 瑤,賴 佳

翼狀胬肉是眼表常見疾病,目前結膜移植是有效降低翼狀胬肉復發的手術方式,但是結膜移植的供區切取面積較大時,結膜不能完全拉攏縫合,存在出現慢性肉芽腫的可能,且較大面積的結膜取材可能導致供區結膜瘢痕化,因此,如何能減少結膜供區損傷是目前需要解決的問題。近來有研究提出,通過組織塊培養法進行自體結膜細胞培養后再回植可供參考。但組織塊培養法要手術切取患者結膜組織,部分患者依從性不好。而患者對于結膜刮片的接受度較高,我們探索能否不切取組織塊,單純通過結膜細胞刮片法培養自體結膜上皮細胞,本研究擬比較兩種不同取材方法結膜細胞培養的差異。

1 材料與方法

1.1材料 收集我院眼科門診2010～2013年原發性翼狀胬肉患者10例(10眼),男性7例,女性3例,年齡34～62(47.3±15.8)歲；病史3～12(6.5±4.1)年。排除血液系統疾病、結締組織病、瘢痕體質、活動期傳染病、角膜緣干細胞缺乏、結膜廣泛瘢痕、淚液分泌功能不良及手術區域外傷手術史患者。所有患者均為原發性翼狀胬肉,診斷標準:顯微血管組織侵入角膜超過1 mm。翼狀胬肉范圍3～5鐘點位,伸入角膜2～4(3.2±0.9)mm,翼狀胬肉分級Ⅱ～Ⅲ級。根據赫爾辛基宣言,本研究經醫院倫理委員會同意,所有患者簽署知情同意書。所有手術及取材均由同一主治醫師操作。

1.2試劑和設備 DMEM/F12組織培養液(Sigma公司),胎牛血清(Sigma公司),一抗:鼠抗人單克隆抗體PCNA、CK13(Sant公司),二抗:熒光標記山羊抗鼠抗體(Sant公司),熒光顯微鏡(奧林巴斯 BX51),手術顯微鏡(拓撲康800型),恒溫孵箱(福意FYL-YS),顯微手術器械(蘇州六六醫療器械公司)。

1.3標本取材

1.3.1結膜上皮組織塊切取 患者麻醉滿意、翼狀胬肉病灶切除后,切取顳下方近角膜緣正常結膜組織,大小2 mm×2 mm,修剪結膜下結締組織,置于DMEM/F12組織培養液的EP管中。按照翼狀胬肉缺損大小,另取相應的結膜移植物,常規進行結膜游離移植。

1.3.2結膜上皮細胞刮片 翼狀胬肉切除手術過程同上,切取細胞培養的結膜上皮組織塊和游離移植的結膜組織后,在下方接近穹窿部,用小圓刀片斜向刮取結膜上皮細胞,一般需要刮取3～5次,以結膜表面微滲血為度,虹膜恢復器將刮取組織轉入DMEM/F12組織培養液的EP管中。

1.4結膜細胞培養方法

1.4.1結膜上皮組織塊 將結膜上皮組織塊上皮面朝瓶壁,加入10%胎牛血清的DMEM/F12培養液放CO2恒溫孵箱培養,待細胞爬壁后去除組織塊,將取下的爬壁結膜上皮細胞離心,常規培養及鑒定[1-2],按照1∶2比例傳代。

1.4.2結膜上皮細胞刮片 將EP管常規離心,去上清,DMEM/F12組織培養液吹打成細胞懸液后,直接轉入含10%胎牛血清、DMEM/F12培養液的培養瓶中,放CO2恒溫孵箱培養,細胞爬滿瓶壁后,常規離心、傳代、鑒定。

1.5觀察指標 共聚焦顯微鏡下觀察結膜上皮細胞生長情況；傳代到第4代后,進行結膜細胞CK、PCNA熒光標記,觀察細胞熒光標記結果。

2 結果

2.1細胞培養生長情況 組織塊培養法,細胞1～3 d貼壁,細胞呈多角形或紡錘形,胞體梭長；5～7 d鋪滿瓶底,排列緊密,細胞呈橢圓形或圓錐形；傳代3～4代細胞外形無明顯變化。刮片培養法,獲得細胞較少,一般1～3 d貼壁,貼壁效率較低,死亡率較高,細胞形態同組織塊培養法,呈多角形或紡錘形,胞體梭長；鋪滿瓶底時間較長,需要14～20 d,細胞排列緊密,呈橢圓形或圓錐形；傳代3～4代細胞外形無明顯變化。見圖1。

2.2細胞鑒定 兩組細胞采用雙標,分別用TRITC標記CK和FITC標記PCNA,均呈陽性,見圖2-3。

圖1 結膜組織塊培養法結膜上皮細胞生長情況

圖2 組織塊培養法熒光標記結果

圖3 細胞刮片培養法熒光標記結果

3 討論

翼狀胬肉的手術方法不斷改進,其主要目的是降低術后的復發率。目前主流的方法是結膜移植、角膜緣干細胞移植和角膜緣干細胞聯合結膜移植,使翼狀胬肉的復發率由原來的20%～70%,降到現在的3%～8%,結合局部運用絲裂霉素、注射雷珠單抗、可吸收生物材料粘合劑等,復發率進一步降低[3-5]。

細胞角蛋白(cytokeratin,CK)可以識別絕大部分酸性細胞角蛋白(Ⅰ型)和堿性細胞角蛋白(Ⅱ型),用于標記上皮及上皮來源的細胞[6-8]。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)由Miyachi等于1978年在系統性紅斑狼瘡(SLE)患者的血清中首次發現并命名,因其只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內而得名。PCNA與細胞DNA合成關系密切,在細胞增殖的啟動上起重要作用,是反映細胞增殖狀態的良好指標[9-12]。關于結膜細胞的鑒定和評價文獻存在爭議,本實驗是為后續研究做準備,要求細胞是結膜細胞而且活性良好,所以選擇CK和PCNA為鑒定指標,CK說明細胞來源是上皮組織,PCNA反映細胞增殖活性。本實驗結果表明,兩種方法培養的細胞的CK和PCNA熒光標記均呈強陽性,說明為結膜上皮來源的細胞,且活性很好。

根據實驗體會,組織塊培養法組織塊要盡量剪小,約1 mm×1 mm,培養液盡量少,剛覆蓋組織塊為度,以免組織塊漂浮貼壁不良；早期4～6 h對于細胞生長非常關鍵,我們會重新換液1次；修剪組織塊時,剪刀要盡量鋒利,避免損傷切面,不利于細胞爬行；后續實驗將細胞用于自體回植,所以,從倫理學考慮,選用無血清培養液。刮片法細胞貼壁效率較低,用酶消化后,細胞分離,相對提高了貼壁的效率。

兩種方法培養的細胞PCNA相似,無明顯差異。但是,組織塊法細胞生長快,技術比較穩定。雖然結膜取組織塊,但是取材組織較小,對患者影響不大；細胞刮片法雖損傷較小,但是細胞貼壁時間長,部分患者刮片效率較低,甚至存在培養失敗的情況。兩種方法比較,建議以小組織塊法較合理。

綜上所述,本實驗探討了兩種不同取材方法的差異,從技術的穩定性和細胞培養效率評價,建議采用組織塊培養法。

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