miR—505慢病毒表達載體的構建

馬驍驍　楊侃　晁天柱　薛慧慧　鄧倩云　常雪瑩　周宇荀

摘要：目的：構建攜帶增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）和miR-505基因的慢病毒載體。方法：采用PCR方法從pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505表達載體質粒擴增出miR-505 shRNA基因編碼區173bp、175、171bp片段，通過限制性酶切、T4DNA連接酶連接，分別將miR-505 shRNA基因插入慢病毒表達載體FUGW與L26Fsy（1.1）GW中，構建成重組載體FUGW-miR-505-3p/5p/nc與Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂質體介導下將慢病毒重組載體轉染至HEK 293T細胞，通過EGFP觀察轉染效率，RT-PCR方法檢測miR-505的表達量。結果：熒光顯微鏡下觀測到HEK 293T細胞轉染后有較強綠色熒光；RT-PCR顯示轉染FUGW-miR-505-3p/5p與Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T細胞中對應miR-505-3p/5p明顯升高。結論：成功構建帶有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表達載體。

關鍵詞：miR-505；慢病毒載體；HEK293T細胞；瞬時轉染；RT-PCR

中圖分類號：R34 文獻標識碼： A 文章編號： 1674-0432（2014）-04-24-3

miRNA（MicroRNA）是近年來備受關注的一類內源性非編碼小分子RNA，長度為21～25個核苷酸，由具有發夾結構約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，通過與其目標mRNA分子的3端非編碼區域（3'UTR）互補配對使其目標mRNA分子的翻譯受到抑制[1～3]。自從1993年第一個miRNA被報道以來，人們發現miRNAs幾乎參與了所有重要的生物學過程的調控[4]，miRNAs的異常表達與人類多種疾病相關[5]。迄今為止，700多種已被鑒定出來的人源性miRNAs調控了人類1/3以上基因的表達。

慢病毒為一類逆轉錄病毒的總稱，與其他逆轉錄病毒載體相比，慢病毒載體主要有以下幾個優點：其一，慢病毒載體既可以轉染處于有絲分裂活躍期的細胞，又可以轉染分裂緩慢及處于分裂終末期的細胞[6]；其二，由慢病毒載體攜帶整合入宿主基因組的目的基因對轉錄沉默作用有較強的抵抗能力，在體外培養細胞實驗和體內移植實驗中，由慢病毒載體攜帶導入的目的基因可以在宿主細胞中得到長期而穩定的表達；其三，慢病毒載體可以兼容多個轉錄啟動子，包括細胞特異性啟動子和在基因組中普遍存在的管家基因的啟動子；其四，經過改建后的慢病毒載體可以容納約10kb左右的外源基因，因此大多數的cDNA都能被克隆入慢病毒載體。慢病毒載體的上述優點使其成為體內和體外基因轉移的一種有效工具，目前慢病毒也被廣泛地應用于表達microRNA的研究中[7]。

泛素啟動子UBC為人和小鼠細胞的組成型啟動子，包含多種轉錄因子，且具有泛素系統本身的特性，與常用的病毒啟動子相比，其細胞來源的特性以及組成型表達的特點可能使它們更加適合驅動外源基因在哺乳動物細胞中的高效表達[8]。另外，大鼠SynaptinI （突觸蛋白I）啟動子（FsyI）是在神經元中特異表達的啟動子。

為提高本研究所用miR-505在中樞神經系統中表達的特異性，選用UBC作為啟動子的慢病毒載體FUGW與大鼠SynaptinI 的慢病毒載體L26Fsy（1.1）GW，構建能高效表達miR-505的慢病毒載體，旨在為進一步的研究打好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505-3p/5p過表達質粒，ASF/SF2過表達載體（上海invitrogen公司）；載體質粒FUGW、L26Fsy（1.1）GW由中科院上海神經所惠贈；PCR引物、測序（上海生工）；EcoRI酶、BamHI等核酸內切酶、klenow大片段、去磷酸化酶、T4 DNA連接酶（大連寶生物工程有限公司）；大腸桿菌感受態細胞DH5α（上海天根化工有限公司）；無內毒素小量質粒抽提試劑盒、中量質粒抽提試劑盒（上海生工）；逆轉錄試劑盒（MBI Fermentas 公司，美國）；陽離子脂質體lipofectamineTM2000（上海invitrogen公司）；HEK293T細胞（本實驗室保存）；DMEM高糖培養基、opti-MEM培養基、FBS（Hyclone，美國），PBS、胰酶（上海寧盛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 miR-505慢病毒載體的構建及鑒定

首先利用以下一對引物：

PcDNA-left：5'CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG

EcoRI BamHI

PcDNA-right：5'CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC

EcoRI BglII

采用PCR方法將帶有側翼的miR-505-3p/5p/nc的shRNA基因從pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505載體質粒（以下簡稱pcDNA-miR-505）擴增得到分別包含miR-505-3p，miR-505-5p及miR-505-nc（有相似結構但無關序列的對照組）的shRNA基因。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，純化回收，EcoRI酶切，再次純化。

EcoRI酶切FUGW和L26Fsy（1.1）GW（以下簡稱Fsy）空載體成線性化，分別與miR-505 shRNA基因片段4oC過夜連接，轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，經菌落PCR篩選出插入目的基因的重組質粒，試劑盒法提取質粒，鑒于FUGW、Fsy空載體序列含有單一BamHI酶切位點，miR-505目的基因片段在5'端也含有一個BamHI酶切位點，進行BamHI酶切檢測目的基因插入的方向和拷貝數，測序確認后，得到表達載體。將連接正確的重組載體命名為FUGW-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p、FUGW-miR-505-nc（簡稱FUGW-miR-505-3p/5p/nc），Fsy-miR-505-3p、Fsy-miR-505-3p、Fsy-miR-505-nc（簡稱Fsy-miR-505-3p/5p/nc）。

1.2.2 細胞培養與轉染

1.2.2.1細胞傳代培養 HEK293T細胞培養于含有10%的FBS和1%的青鏈霉素的DMEM高糖培養基中，置于培養箱中37℃，5% CO2，取對數生長期細胞進行轉染試驗。

1.2.2.2脂質體法轉染 采用脂質體法將pcDNA-miR-505-3p/5p/nc與構建成功的重組載體FUGW-miR-505-3p/5p/nc，Fsy-miR-505-3p/5p/nc分別轉染至HEK293T細胞。

實驗前將HEK293T細胞以5×105/孔密度接種于12孔板。轉染前2小時將DMEM高糖培養基換成opti-MEM培養基，待轉染的細胞為單層并處于對數中期，融合度選擇為70%～80%時進行轉染。12孔板各孔轉染用質粒與脂質體Lipofectamine2000分別為2微克和4微升，轉染步驟按脂質體Lipofectamine2000轉染試劑說明書操作。轉染后6小時更換成含有4%青鏈霉素的正常DMEM高糖培養基。轉染后細胞置培養箱37℃，5%CO2孵育48小時。48小時，Trizol法提取12孔板細胞的總mRNA。

1.2.3 RT-PCR法檢測miR-505-3p/5p含量 采用Trizol法抽提的總mRNA，具體操作按照說明書進行，以總RNA為模板，以下列特異引物進行逆轉錄反應，得到各目的基因的cDNA。

逆轉錄引物：miR-505-3p：5'GCGTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGCAGAAAACCA

GC，

miR-505-5p：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT

ATTCGCACTGGATACGACAACATCAATA，

m16基因：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT

TCGCACTGGATACGACCGCCAA

逆轉錄步驟按試劑盒說明書操作。制備的cDNA稀釋5倍作為模板，進行實時熒光定量PCR反應，miR-505-3p基因上游引物：GCGAGCACCGTCAACACT，下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCGGC，

miR505-5p基因上游引物：GCCCGGGAGCCAGGAAG，下游引物：CAGGGTCCGAGGTATTCGCAC，

m16基因上游引物：CGCGCTAGCAGCACGTAAAT，下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。95oC變性2s，62℃退火延伸32s，共反應40個循環，分析溶解曲線。 △Ct=Ct（miR-505-3p/5p/nc）-Ct（m16），△△Ct=△Ct（miR-505-3p/5p）-△Ct（miR-505-nc）表示miR-505-3p/5p的表達，2-△△Ct表示實驗組與對照組miR-505表達量差異。

1.3 統計方法

實驗數據均以均值+標準差表示，依SPSS10.0統計學軟件進行t檢驗，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結果

2.1 miR-505慢病毒重組載體的鑒定

PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳示分別在173bp、175bp、171bp左右有特異擴增條帶，與預期相符，產物單一，說明引物特異性較好（圖1）。

菌落PCR產物1%的瓊脂糖凝膠電泳出現3種特異性條帶，分別于：208bp、416bp、624bp左右（圖2），說明目的小片段插入載體上的拷貝數不同，分別為1、2、3。

根據載體與目的片段上BamHI酶位點位置，BamHI酶切可以鑒定插入片段的方向。瓊脂糖凝膠電泳結果示，對于插入一個拷貝的重組載體來說，770bp左右處出現特異性條帶為正向插入，反之913bp處出現特異性條帶為反向插入。而對于插入兩拷貝的重組載體也顯示出兩種情況：770bp、161bp處同時出現條帶，913bp與161bp處同時出現條帶，前者為兩拷貝都正向插入，后者則為兩拷貝都反向插入（圖3）。

選取正向插入的重組載體進行測序，結果與GenBank中提供的序列一致，證明載體構建成功（圖4）。

以FUGW-miR-505-3p為例，構建成功的載體圖譜如圖5。

2.2 miR-505對HEK293T細胞的轉染

質粒轉染HEK 293T細胞后48小時，于熒光顯微鏡下觀察發現，三組質粒轉染的細胞中都有EGFP綠色熒光表達有差異，組內綠色熒光表達相差不大。其中FUGW組表達熒光強度最高，pcDNA組次之，Fsy組最弱，（圖6）。

2.3 RT-PCR檢測細胞中miR-505表達水平

抽提總RNA，RT-PCR結果顯示：轉染48小時時，轉染質粒pcDNA-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p與Fsy-miR-505-3p的細胞中miR-505-3p明顯增高，miR-505-5p幾乎無變化（圖7A，p<0.05）。轉染質粒pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p與Fsy-miR-505-5p的細胞中miR-505-5p也明顯增高，miR-505-3p幾乎無變化（圖7B，p<0.05），說明構建的表達載體能實現microRNA的過表達。

3 討論

miR-505位于小鼠X染色體X：57647578-57647667處，ATP11C基因的第一和第二個外顯子之間的第一個內含子中，對于其生物學功能的研究目前還處于起步階段。2010年，Verduci L等發現miR-505能通過作用于其靶標ASF/SF2（可變剪接因子）發揮調控小鼠胚胎成纖維細胞的增殖和衰老/凋亡的作用[9]。Karni R等發現在許多細胞中轉染ASF/SF2可以激活mTOR部分信號通路[10]。Yamamoto Y等在研究腫瘤多藥抗性時，發現miR-505是一個新的腫瘤抑制miRNA，與其呈現負相關的蛋白Akt3，與mTOR通路上的AKT屬于同一基因家族[11]。因此miR-505極有可能通過調控mTOR信號通路發揮其生物學功能，而mTOR通路是目前分子生物學研究的熱點，它能整合細胞內和細胞間的信號，起到調控細胞代謝，生長，增殖和存活等過程的中心調控者的作用，mTOR通路的改變與多種疾病相關[12]。

在細胞水平對小RNA進行研究，可采用合成的雙鏈siRNA或者構建在表達載體上的shRNA轉染細胞進行。由于有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制[13]。

采用事先在體外構建能夠表達shRNA的載體， 然后轉移到細胞內轉錄shRNA，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用[14]。

本實驗成功將miR-505的基因片段克隆到具有神經元特異性的慢病度真核表達載體中，并通過瞬時轉染的方法轉染HEK293T細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染構建的慢病毒載體在HEK293T細胞中EGFP熒光表達，實時定量PCR結果也表明HEK293T細胞中能高表達miR-505，證明構建載體成功?？傊覀儗⒗脴嫿ǔ晒Φ穆《颈磉_載體對miR-505的功能進行更加深入的研究，對miR-505調控的靶基因以及其他小分子RNA之間是否存在功能上的關聯進行深入研究，以期進一步闡明miR-505的功能。

參考文獻

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[8] 趙慧，鄭文嶺，崔東，馬文麗.泛素啟動子的研究進展[J].廣東醫學，2003，24（12）：1376-1377.

[9] Verduci，L，Simili M，Rizzo M，Mercatanti A，Evangelista M et al.MicroRNA （miRNA）-mediated Interaction between Leukemia/ Lymphoma-related Factor （LRF） and Alternative splicing factor/splicing factor 2（ASF/SF2） affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis[J].Biol Chem，2010，285（39）：551-563.

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[11] Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al.An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells[J].Mol Cancer，2011，10（135）：39551-39563.

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[13] Kim VN. RNA interference in functional genomics and medicine[J].J Korean Med Sci， 2003，18（3）：309-318.

[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者簡介：馬驍驍，東華大學生物科學與技術研究所，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學；周宇荀，東華大學生物科學與技術研究所，副教授，研究方向：醫學分子遺傳學。

網絡出版時間：2014-3-11 10：20：32

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1186.S.20140311.1020.002.html

在細胞水平對小RNA進行研究，可采用合成的雙鏈siRNA或者構建在表達載體上的shRNA轉染細胞進行。由于有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制[13]。

采用事先在體外構建能夠表達shRNA的載體， 然后轉移到細胞內轉錄shRNA，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用[14]。

本實驗成功將miR-505的基因片段克隆到具有神經元特異性的慢病度真核表達載體中，并通過瞬時轉染的方法轉染HEK293T細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染構建的慢病毒載體在HEK293T細胞中EGFP熒光表達，實時定量PCR結果也表明HEK293T細胞中能高表達miR-505，證明構建載體成功。總之，我們將利用構建成功的慢病毒表達載體對miR-505的功能進行更加深入的研究，對miR-505調控的靶基因以及其他小分子RNA之間是否存在功能上的關聯進行深入研究，以期進一步闡明miR-505的功能。

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[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者簡介：馬驍驍，東華大學生物科學與技術研究所，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學；周宇荀，東華大學生物科學與技術研究所，副教授，研究方向：醫學分子遺傳學。

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在細胞水平對小RNA進行研究，可采用合成的雙鏈siRNA或者構建在表達載體上的shRNA轉染細胞進行。由于有些類型細胞脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制[13]。

采用事先在體外構建能夠表達shRNA的載體， 然后轉移到細胞內轉錄shRNA，不但使脂質體有效轉染的細胞種類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發揮長期阻斷基因表達的作用[14]。

本實驗成功將miR-505的基因片段克隆到具有神經元特異性的慢病度真核表達載體中，并通過瞬時轉染的方法轉染HEK293T細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染構建的慢病毒載體在HEK293T細胞中EGFP熒光表達，實時定量PCR結果也表明HEK293T細胞中能高表達miR-505，證明構建載體成功?？傊覀儗⒗脴嫿ǔ晒Φ穆《颈磉_載體對miR-505的功能進行更加深入的研究，對miR-505調控的靶基因以及其他小分子RNA之間是否存在功能上的關聯進行深入研究，以期進一步闡明miR-505的功能。

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[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者簡介：馬驍驍，東華大學生物科學與技術研究所，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學；周宇荀，東華大學生物科學與技術研究所，副教授，研究方向：醫學分子遺傳學。

網絡出版時間：2014-3-11 10：20：32

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