腦梗死患者外周血血清和血漿中白細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9及基質(zhì)金屬蛋白酶組織掏因子1水平差異分析

細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡失調(diào)是血管重構(gòu)和動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的主要病理過(guò)程,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)屬于基質(zhì)蛋白酶家族,能夠降解所有細(xì)胞外基質(zhì)成分,同時(shí)也是變性和炎癥過(guò)程的主要調(diào)節(jié)分子,在血管壁重構(gòu)以及心腦血管病發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色,目前MMPs已經(jīng)作為動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管病的預(yù)測(cè)因子[1]。本研究旨在探討血清及血漿中白細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的水平差異，為腦組織損傷生物標(biāo)志物的選擇提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 一般資料 收集臨床資料:腦梗死患者116例為腦梗死組,男61例,女55例。年齡51～77歲,平均(68.0±6.6)歲。健康體檢者43例為健康組,男23例,女20例。年齡48～59歲,平均(53.0±5.7)歲。所有病例經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí),臨床表現(xiàn)符合《中國(guó)腦血管病防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn),發(fā)病<1周的患者。腦梗死納入標(biāo)準(zhǔn): 符合動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死、腔隙性梗死的診斷,并具有神經(jīng)功能缺損的臨床表現(xiàn)者。排除標(biāo)準(zhǔn): 短暫性腦缺血發(fā)作(TIA);腦出血;發(fā)病>1周;經(jīng)檢查證實(shí)由腦腫瘤、腦外傷、血液病等引起的卒中患者,因風(fēng)濕性心臟病、冠心病及其他心臟病合并房顫引起腦栓塞者;合并有肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及骨關(guān)節(jié)病、精神病者。

1.2 方法 血清、血漿采集:分別采用無(wú)促凝劑的采血管、含EDTAK2抗凝管(購(gòu)自上?？迫A)清晨空腹采血,3000 r/min離心20 min,取上清置于-80 ℃保存,避免反復(fù)凍融。

MMP9和TIMP-1的水平檢測(cè)：采用ELISA法，樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)復(fù)孔,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo),OD值為橫坐標(biāo),采用ELISA-0.2軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的四參數(shù)Logistic曲線擬合方程,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。ELISA試劑購(gòu)自蘇州科創(chuàng)生物技術(shù)公司,Biotek 酶標(biāo)儀(美國(guó) ELX800)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5,血清和血漿組間MMP9及TIMP-1含量差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。腦梗死組與健康組血漿MMP9和TIMP-1差異比較采用成組t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組血清和血漿MMP9和TIMP-1水平比較 116例腦梗死患者血清和血漿中MMP9水平及TIMP-1水平均呈線性相關(guān),血清MMP9水平顯著高于血漿MMP9水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 血清TIMP-1水平亦顯著高于血漿TIMP-1水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

項(xiàng)目血清血漿相關(guān)系數(shù)(r) MMP91194.59±69.9837.82±73.5??0.62 TIMP-1172.56±12.983.57±7.0??0.87

注:與血清比較,**P<0.01

2.2 腦梗死組與健康組血漿MMP9和TIMP-1水平比較 本研究腦梗死組MMP9血漿水平顯著高于健康組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而腦梗死組TIMP-1血漿水平顯著低于健康組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表2。

3 討論

正常和病態(tài)血管壁細(xì)胞能夠在可溶性細(xì)胞因子以及細(xì)胞和細(xì)胞血小板白細(xì)胞之間相互作用活化和上調(diào)MMPs水平,MMPs活性增強(qiáng)有益于基質(zhì)的轉(zhuǎn)化,血管的修復(fù)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定,但是也能導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成[2]。MMP9和TIMP-1水平的不同不僅與疾病狀態(tài)相關(guān),同時(shí)也與血凝和纖維溶解途徑相關(guān)。凝血過(guò)程中凝血酶能夠促進(jìn)MMP9前體和MMP9的活化,凝血酶產(chǎn)生纖維蛋白,連接MMP9單體的纖維蛋白連接域,繼而活化的MMP9單體在血清聚集,在纖維蛋白溶解過(guò)程,尿激酶纖溶酶原激活劑促進(jìn)白細(xì)胞產(chǎn)生MMP9[3],外周血中MMPs和TIMP-1水平在血清與血漿水平存在差異,血清MMP9和TIMP-1的水平高于含有抗凝劑的血漿,本研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道相一致[4],由于血小板和白細(xì)胞在聚集或活化時(shí)能夠釋放MMP9和TIMP-1,而使用抗凝劑能夠抑制血小板和白細(xì)胞釋放MMP9和TIMP-1[5]。因此對(duì)于研究MMP9和TIMP-1作為生物學(xué)標(biāo)志和其在病理生理過(guò)程中的角色,采血方法和樣本前處理非常重要。忽視采血方法對(duì)結(jié)果的影響,可能影響對(duì)正常結(jié)果的判斷分析。

組別nMMP9TIMP-1 腦梗死組116837.82±73.5??83.57±7.0?? 健康組43181.36±7.3186.61±43.5

注:與健康組比較,**P<0.01

腦梗死在缺血組織內(nèi)以及其周圍出現(xiàn)高水平MMP9,可能引起出血原因是毛細(xì)血管基底膜大量Ⅳ膠原降解,紅細(xì)胞和白細(xì)胞外滲。MMPs由腦細(xì)胞和循環(huán)至腦組織的外周血白細(xì)胞產(chǎn)生,局部缺血后滲透的白細(xì)胞是MMP9 的主要來(lái)源[6]。白細(xì)胞MMP9敲除嵌合子小鼠與MMP9敲除鼠具有相同表現(xiàn)。腦組織和血中MMP9促進(jìn)神經(jīng)元死亡、炎癥、滲透、神經(jīng)血管損傷。MMP9參與神經(jīng)和血管病理生理過(guò)程。血漿水平MMPs已經(jīng)作為腦組織損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)志[7-8]。與健康人比較,缺血性腦卒中患者外周血MMP9水平增高,且與缺血面積及神經(jīng)癥狀有關(guān)[9], TIMP-1作為MMP9活性的主要抑制物,與MMP9特異性結(jié)合,TIMP-1和MMP9之間平衡調(diào)節(jié)是血管重構(gòu)的關(guān)鍵,TIMP-1和MMP9之間平衡失調(diào)可能導(dǎo)致腦卒中后梗死擴(kuò)大,損傷血腦屏障[8]。

總之,血漿水平MMP9和TIMP-1更適合作為腦組織損傷的潛在生物學(xué)標(biāo)志，使用血清標(biāo)本檢測(cè)MMP9和TIMP-1可能產(chǎn)生分析前的偏倚。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sundstr?m J, Vasan RS. Circulating biomarkers of extracellular matrix remodeling and risk of atherosclerotic events[J]. Curr Opin Lipidol, 2006,17(1):45-53.

[2] Androulakis E, Tousoulis D, Papageorgiou N, et al. The role of matrix metalloproteinases in essential hypertension[J]. Curr Top Med Chem, 2012,12(10): 1149-1158.

[3] Mannello F. Effects of blood collection methods on gelatin zymography of matrix metalloproteinases [J]. Clin Chem,2003,49(2):339-340.

[4] John M, Jung K. Pre-analytical conditions for the assessment of circulating MMP-9 and TIMP-1: consideration of pitfalls[J]. Eur Respir J,2005,26(2):364-366.

[5] Jung K, Gerlach RF, Tanus-Santos JE. Preanalytical pitfalls of blood sampling to measure true circulating matrix metalloproteinase 9 and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases[J]. Clin Chim Acta, 2006,373(1/2):180-181.

[6] Gidday JM, Gasche YG, Copin JC, et al. Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood—brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005, 289(2):H558-H568.

[7] 梁恒,韓江全,李繼中,等. MMP9、hs-CRP、BNP、S-100和DD在急性缺血性腦卒中患者中的臨床診斷意義[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥, 2012, 7(24):4-6.

[8] 謝明劍,薛偉新,邱楚雄,等. 腦梗死病人梗死面積與MMP1、MMP9、TIMP-1的關(guān)系探討[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2011, 9(2):173-174.

[9] 劉長(zhǎng)海. 血清MMP-9、Hs-CRP檢測(cè)在缺血性腦卒中患者中的意義[J]. 中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志, 2013, 16(2):35-37.