侵襲性念珠菌感染的實驗室研究進展

蘇建榮，丁秀榮

侵襲性念珠菌感染的實驗室研究進展

蘇建榮，丁秀榮

近年來，侵襲性念珠菌感染的流行趨勢發生了改變，致病菌種也有明顯變遷。除光滑念珠菌和克柔念珠菌外，大部分念珠菌對常用抗真菌藥物仍然敏感。隨著分子生物技術的應用，真菌感染早期的、特異診斷水平有了明顯提高，對真菌耐藥機制的認識也更加深入。本文就侵襲性念珠菌感染的實驗室研究進展進行綜述。

念珠菌病；流行學；實驗室；診斷；抗藥性；真菌

侵襲性真菌感染（invasive fungal infections,IFI）是指真菌侵入內臟、血液、黏膜或表皮角質層以下深部皮膚結構引起的感染。80%的IFI由念珠菌引起，其中由白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌引起的感染占念珠菌血癥的97%，其余的則由12～14種較稀有的念珠菌引起[1]。在過去的20年中，念珠菌血癥的發生率增加了10倍，致病菌種也有明顯變遷[2]。提高真菌感染的早期、特異診斷水平，充分認識其耐藥機制，成為臨床檢驗工作中急須解決的問題。

1 侵襲性念珠菌感染（invasive Candida infection,IFI）的流行趨勢

1.1 發病率和危險因素近30年來，隨著免疫功能低下患者的不斷增加，IFI呈持續增多趨勢。根據我國醫院感染監控網顯示，真菌感染率由1999年的0.16%（519/324337）到2000年的0.23%（2522/ 1096461）再到2002年的0.24%（4323/1799868），呈不斷上升趨勢[3]。在美國，念珠菌血癥在醫院血流感染中位居第4，而且，與1992—1993年相比，2008—2011年由近平滑念珠菌和光滑念珠菌引起的IFI的比例分別增加了2倍和4倍[4]。歐洲的情況同樣不容樂觀，2006年，英國健康保護局公布，在英國每年大約有5000例IFI[5]。

IFI患者中，65歲以上的老年患者占83.1%[6]，無疑，人口老齡化是當今IFI高發的一個重要社會因素。醫療技術的進步，也為IFI的發生提供了可乘之機。據文獻統計，90%的念珠菌血癥患者在近期使用過抗生素；80%以上有中心靜脈導管和腸外營養治療史，50%以上有外科手術史（30 d內），10%以上有腫瘤化療史[7-9]。入住重癥監護病房（intensive care unit,ICU）也是IFI的危險因素。Yang等[10]發現，39.7%的IFI病例發生在ICU。預防性使用氟康唑，則是公認的非白色念珠菌（光滑念珠菌和克柔念珠菌）感染的危險因素[5，7]。此外，器官移植、腎替代治療、機械性通氣等也與IFI相關，但其相關性不同文獻報道差異較大。

1.2 菌株分布引起IFI的念珠菌多達30多種。其中，白色念珠菌的感染率一直居首位。尤其在北歐和瑞士，由白色念珠菌引起的感染占IFI的60%以上。近年來，非白色念珠菌的感染率不斷升高，在某些地區甚至超過白色念珠菌的感染率，而且其菌種分布有明顯的地域性。例如，光滑念珠菌在美國感染率為18.8%～24.0%，在英國為22.7%，而在巴西僅為4.9%。近平滑念珠菌比較容易從科威特（30.6%）和西班牙（23.0%）分離到，而在北歐其感染率僅為4.4%。熱帶念珠菌在南美的感染率最高（20.9%～24.2%)，在北歐最低（4.0%）[11]。菌種分布差異在我國國內也存在。近期一項多中心的研究顯示，由非白色念珠菌引起的血流感染中，近平滑念珠菌最常見[12]。但在南京市[13]、重慶市[14]等南方地區，熱帶念珠菌的感染率居非白色念珠菌的首位。基于這種菌種分布的差異，及時調查當地的真菌流行情況，比參照全球或全國性的報道對臨床更有指導價值。

1.3 耐藥性近年來，關于念珠菌耐藥的報道層出不窮。事實真的如此嗎?拉丁美洲一項多中心的研究顯示，99%以上的白色念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌對氟康唑敏感，光滑念珠菌中92.9%為劑量依賴敏感，7.1%對氟康唑耐藥[8]。在意大利和西班牙，98.6%的白色念珠菌、97.3%的近平滑念珠菌、95.5%的熱帶念珠菌和54.4%的光滑念珠菌對氟康唑敏感[15]。在中國，對氟康唑敏感的白色念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌占到94%以上，光滑念珠菌中87.8%為劑量依賴敏感，12.2%對氟康唑耐藥[12]。可見，白色念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌對唑類藥物的敏感率仍很高；而光滑念珠菌的耐藥率不同報道間存在較大差異。這可能與當地氟康唑的預防性使用情況相關，與其他念珠菌相比，光滑念珠菌在氟康唑的選擇壓力下更容易發展為耐藥菌[16]。

近年來，棘白菌素類藥物在臨床上的使用開始增多，除了近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌外，99%以上的臨床常見念珠菌可被＜2μg/ml的棘白菌素類藥物所抑制，即使對氟康唑耐藥的念珠菌及其生物膜也有較好的殺菌效果[16]。調查顯示，2001—2004年，血流來源的耐氟康唑的光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率為0.9%（1/110），2006—2010年耐藥率增長到11.1%（18/162），而且這些耐藥株均來自美國[17]。一項全球性調查顯示，血流來源的耐氟康唑的光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率北美洲為3%，歐洲為1%，拉丁美洲為0%，亞太地區為0%[18]。可見，隨著棘白菌素臨床應用的增加，念珠菌對其耐藥率也隨之發生著變化。

2 IFI的分子實驗室診斷技術

IFI早期癥狀隱匿，病死率高。如何提高真菌感染的早期、特異診斷水平是目前臨床真菌學領域的研究熱點，也是臨床檢驗中要解決的關鍵問題。近年來分子生物技術的發展和應用，為真菌感染的早期診斷提供了新的思路。

2.1 聚合酶鏈反應（PCR）PCR方法是目前分子診斷中最常用的方法，可將菌種鑒定時間由傳統方法的24～48 h縮短到6～8 h。一項大型薈萃分析顯示，在確診或疑似IFI患者中，PCR方法檢測的陽性率為85%（78%～91%），而血培養方法的陽性率為38%（29%～46%）；采用實時PCR檢測念珠菌血癥的靈敏度和特異度分別為87%和100%，而平行的2種血清學方法的靈敏度和特異度分別為47.5%和82.6%以及96%和81%，均不及PCR方法[19]。

污染是臨床應用PCR方法的主要障礙，其陽性結果無法區分是感染、污染還是定植。缺乏標準化也是PCR方法的一個重要缺陷，限制了其在臨床實踐中的廣泛應用。

2.2 基因芯片技術基因芯片技術是一種以高通量為特點的檢測技術。商品化的基因芯片，如芬蘭的Prove-itTMSepsis assay，可同時鑒定34種細菌和8種真菌，而且，它既可以檢測分離株又可以直接檢測陽性血培養物，靈敏度和特異度分別為94.0%和98.0%[20]。Aittakorpi等[1]將該芯片的念珠菌檢測范圍擴展到了13種，經驗證其靈敏度和特異度分別為99%和97%。Leaw等[21]設計的芯片可檢測77種真菌，其中包括44種念珠菌，該芯片的靈敏度為100%，特異度為97%。利用芯片技術不僅將菌種鑒定時間縮短到3～4h，還可以同時鑒定混合感染中的多種病原菌，無須分離培養，從而進一步縮短了鑒定時間。

但是，基因芯片技術對DNA的量和純度要求較高，費用也高，所以尚未在臨床真菌檢驗中廣泛使用。但是，基因芯片技術快速、高通量和靈敏的優勢，無疑使其具有極大的應用前景。

2.3 焦磷酸測序技術焦磷酸測序技術是新一代DNA測序技術。該方法的重復性和精確性可與傳統的Sanger法相媲美，但不需要電泳，不需要對樣品標記和染色，檢測速度大大提高。焦磷酸測序技術對念珠菌屬中的大多數致病菌可準確鑒定，且可區分表型非常相近的念珠菌。Borman等[22]運用焦磷酸測序技術，從1839株白色念珠菌標本中鑒定出15株C.africana，并明確區分出近平滑念珠菌復合體中的C.parapsilosis、C.metapsilosis和C.orthopsilosis菌種。

目前，焦磷酸測序僅能測定100 bp以內的核酸片段，對重復序列測定準確性較差，鑒定親緣關系較近的菌株可能須借助不止一對引物。

2.4 質譜技術近年來，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技術在微生物鑒定中的應用受到廣泛關注。商品化的微生物鑒定質譜儀主要有布魯克公司的MALDI BiotyperTM和梅里埃公司的VITEK MSTM，質譜數據庫中有近4000種常見微生物的特征指紋圖譜，用戶還可以根據需要隨時添加。

MALDI-TOFMS對念珠菌分離株的鑒定準確率為96%～100%，也可以直接鑒定陽性血培物中病原真菌，并且可區分表型和基因型非常相近的菌種[23-24]。Spanu等[25]用MALDI-TOFMS技術對340份陽性血培養標本進行檢測，對白色念珠菌和非白色念珠菌的檢測靈敏度分別為95.9%和86.5%，菌種鑒定時間縮短到30min，但該方法對同時存在多種病原體的標本無法鑒定。

MALDI-TOFMS對微生物的鑒定是通過所獲得的質譜圖與已知數據庫進行匹配分析來實現的，所以對待測標本質譜信息有影響的因素，以及相關數據庫的構成和質量對其鑒定的準確性有影響[26]。

3 念珠菌對常用抗真菌藥物的耐藥機制

借助分子生物技術，人們對真菌的耐藥機制有了深入的了解，特別在念珠菌對唑類藥物和棘白菌素的耐藥機制研究中取得了長足的進步。

3.1 對唑類藥物的耐藥機制唑類藥物的作用靶位酶為14-α-去甲基酶（14-DM），它是真菌細胞膜麥角甾醇合成的關鍵酶。14-DM由ERG11基因編碼。據文獻報道，白色念珠菌的唑類耐藥株均存在ERG11的多點突變，和（或）ERG11的過度表達；而編碼麥角甾醇合成途徑中其他酶的基因（如ERG3、ERG5、ERG24、ERG6等）的突變或過度表達也可降低白色念珠菌對唑類藥物的敏感性[27]。

多耐藥轉運蛋白也與白色念珠菌對唑類藥物耐藥密切相關。目前已知的多耐藥轉運蛋白是ABC轉運蛋白和主要易化載體超家族（MFS）。其中，編碼ABC轉運蛋白的CDR基因中僅CDR1和CDR2與唑類藥物耐藥相關，而且，CaCDR1的高表達比CaCDR2更關鍵[28]。編碼MFS的MDR基因僅與念珠菌對氟康唑的耐藥相關，與其他唑類藥物的交叉耐藥無關；而編碼MFS的另一基因FLU1，是否與唑類藥物耐藥相關，尚待確定[29]。

在光滑念珠菌對唑類藥物的耐藥機制中起主導作用的是編碼ABC轉運蛋白的CgCDR1和CgCDR2基因，其中CgCDR2的過度表達起主要作用。尚無證據表明光滑念珠菌ERG11基因突變或表達水平改變參與其對唑類藥物耐藥。

與光滑念珠菌相反，熱帶念珠菌耐藥株不僅ERG11基因的表達明顯上調，而且存在多點突變（主要是Y132F和S154F）。但編碼多耐藥轉運蛋白CDR1和MDR1的基因表達量無明顯改變[30]。

3.2 對棘白菌素的耐藥機制棘白菌素的靶位酶是位于真菌細胞壁的1,3-β-D葡聚糖合成酶，其編碼基因是FKS（FKS1和FKS2）。對棘白菌素耐藥的白色念珠菌的基因突變主要發生在FKS1的2個熱點區：氨基酸殘基641～649和殘基1345～1365。光滑念珠菌的基因突變則發生在FKS1或FKS2。據報道，美國發現的18株耐棘白菌素的光滑念珠菌中，9株為FKS1突變，7株為FKS2突變。而近平滑念珠菌對棘白菌素天然不敏感，因為該菌種FKS1的第660個氨基酸殘基——脯氨酸被丙氨酸所代替[16]。

目前研究較多的還有熱休克蛋白90（Hsp90）調節的念珠菌屬對棘白菌素的耐藥。Hsp90通過其客戶蛋白參與念珠菌多條信號轉導通路的調節，對真菌由于快速選擇而產生的耐藥性及這種耐藥性的維持起重要作用[31]。Hsp90最關鍵的客戶蛋白是鈣調磷酸酶，Hsp90就是通過穩定鈣調磷酸酶的催化亞基，實現對白色念珠菌的棘白菌素耐受性的調節，該過程中鈣調磷酸酶的下游效應因子Crz1也發揮了重要作用。適量的Hsp90抑制劑（格爾德霉素或赤根殼菌素），可減弱白色念珠菌對棘白菌素的耐受性，并與棘白菌素產生協同抗菌作用，這充分肯定了Hsp90在調節念珠菌屬對棘白菌素耐藥中的作用。

在研究念珠菌對棘白菌素的耐藥機制時，一個值得注意的現象就是矛盾生長現象。該現象是指在微量肉湯稀釋法藥物敏感性（藥敏）實驗中，某些種類的念珠菌在較低濃度的棘白菌素中被殺死，而在較高濃度的棘白菌素中持續存在時反而生長的現象。隨著對該現象研究的不斷深入，多數研究者認為，該現象可能只是念珠菌的一種自我補償機制而非耐藥機制。而且，Shields等[32]發現該現象的發生可被健康人血清所抑制，認為該現象不會在體內發生。

3.3 藥敏影響因素須注意的是，血清、溫度和pH值等因素，會對不同抗真菌藥物的敏感性產生不同的影響。

3.3.1 血清人類血清對多種抗真菌藥物的藥效學有影響。如在血清存在情況下，氟康唑對白色念珠菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）平均降低2個稀釋度（4倍）；而伊曲康唑和酮康唑的MIC卻明顯升高；兩性霉素B的MIC雖然不變，但其殺菌活性和后續殺菌效應降低；米卡芬凈和阿尼芬凈對不同念珠菌的MIC也明顯升高；但卡泊芬凈受影響較小[16]。以上表明，血清對蛋白結合率高的藥物或許有降低藥效的影響，這須要提請臨床醫師注意。

3.3.2 溫度念珠菌血癥患者常伴發高熱。研究者將體外藥敏實驗的培養溫度提高到39℃，發現在此溫度下米卡芬凈顯示出比37℃時更好的殺菌效果[33]。如果這方面的實驗結果得到廣泛證實，那么對我們更好利用抗真菌藥物會有所幫助。

3.3.3 pH值霉菌性陰道炎是婦科常見病，那么陰道特殊的pH值條件是否會影響抗真菌藥物的療效呢？研究表明，在pH值≤4時，念珠菌對唑類藥物和兩性霉素B的敏感性降低，但對棘白菌素的敏感性不受影響[34]。

4 結語

IFI的發病率逐年上升，對其早期、快速、準確診斷，對高危患者的救治有重要意義。真菌分子生物檢測方法具有方便、快速等優勢，有較好的應用前景。深入研究真菌對常用抗真菌藥物的耐藥機制則有利于臨床合理使用抗真菌藥物，控制真菌耐藥性的發生。對臨床疑似IFI的患者，應聯合應用多種檢測技術進行診斷，并合理使用抗真菌藥物，防止耐藥菌的產生和傳播。

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（2014-07-19收稿2014-08-22修回）

（責任編委曲芬本文編輯王姝）

Laboratory study on invasive Candida infections:an update

SU Jian-rong,DING Xiu-rong
Clinical Laboratory Center,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China

The epidemiology of invasive Candida infections has changed markedly in recent years.Obvious changes also have taken place in the distribution of pathogenic fungi.Most of Candida isolates are susceptible to common antifungal agents,except C. glabrata and C.krusei.With more and more widespread and profound application ofmolecular biological techniques in researches of fungi,the level of early and specific diagnosis of fungal infections has improved significantly and the understanding of resistance mechanism of fungi is alsomuch deeper.This article focuses on laboratory study on invasive Candida infections.

candidiasis;epidemiology;laboratory;diagnosis;drug resistance;fungal

R519.3

A

1007-8134(2014)05-0311-04

100050，首都醫科大學附屬北京友誼醫院臨床檢驗中心（蘇建榮、丁秀榮）