骨形態發生蛋白9介導的成骨及其調控研究進展

譚富強，劉 渤

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)最初是在Urist研究脫鈣的骨基質可誘導骨形成中被發現[1]，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一,在骨骼發育、骨形成和干細胞分化中起著至關重要的作用。人類中被鑒定的BMP至少有15種，其中BMP2、4、6、7和9具有成骨能力，而BMP9是目前公認的BMP家族中成骨能力最強的蛋白。BMP9也被稱為生長分化因子2(growth differentiation factor 2，GDF-2)，最初是胎鼠肝cDNA文庫中分離而來，可在小鼠肝臟中高表達并刺激干細胞增殖[2]。目前研究發現，BMP9在調節糖脂代謝及造血細胞功能、誘導軟骨細胞分化，調控血管生成及腫瘤發生等方面均具有重要作用。而在BMP9成骨研究領域，近年也取得了較多進展。

1 BMP9的結構特點

人的BMP9位于10 q11.22染色體，其前體蛋白包含428個氨基酸殘基，與BMP2、4、5、6、7、8分子前體蛋白的氨基酸序列50%～55%相同，BMP9前體蛋白能維持成熟BMP9的功能及穩定性。BMP9具有蝴蝶樣構型的半胱氨酸支架結構，包含1個α螺旋表位和2個從中心延伸出的β片層，BMP9與其他BMP表現出的受體結合差異性與其螺旋袢上的殘基及結合界面上的氨基酸不同有關[3]。

2 BMP9的成骨作用

2.1BMP9誘導成骨 Kang等[4]通過重組腺病毒AdEasy系統介導的方法，成功構建了AdBMP2～AdBMP15等14種腺病毒，轉染C2C12細胞后結果顯示BMP2、6、7、9均能在體內誘導骨形成，其中BMP9誘導成骨效應最強； 直接肌肉注射AdBMPs誘導的原位成骨效應較AdBMPs轉染成骨祖細胞誘導的成骨效應弱，提示基于成骨祖細胞或干細胞的基因治療是促進骨再生更有效的方法。Sheyn等[5]首次利用超聲微泡技術將成骨基因導入小鼠股四頭肌內，通過熒光素酶的表達、微型CT及組織學分析，結果顯示重組人BMP9直接的聲孔效應可引起異位骨的形成； 利用一種新型的電穿透技術，Aslan等[6]將人骨髓間充質干細胞(hMSC)和BMP9進行核轉染，4周后可觀察到骨組織形成?？梢?，BMP9是一種強有力的骨形成誘導因子。

2.2BMP9與骨再生 近年研究發現，BMP9在促進脊柱融合和修復骨缺損中具有重要作用。Dumont等[7]經皮向16只裸鼠腰部棘突與椎板之間注射AdBMP9轉染的hMSCs，8周后，CT掃描和組織學分析均證實在注射區域即腰椎棘突、椎板與關節突之間有大量的異位骨形成，脊柱融合獲得成功。Kimelman-Bleich等[8]通過建立小鼠的骨不連模型，明膠海綿填充骨缺損處，10d后利用BMP9治療，可在骨缺損處形成骨橋并修復骨不連。在研究BMP9誘導肌源性干細胞成骨分化過程中，Li等[9]建立小鼠橈骨12mm骨缺陷模型，相比于BMP2對照組，BMP9處理組在骨缺損區域表現出更快、更多的骨橋形成。由此可見，BMP9具有強大的促骨再生作用。

3 BMP9成骨信號及其調控

研究發現，BMP9誘導成骨作用不被公認的成骨抑制劑骨形態發生蛋白3(BMP3)及頭蛋白(Noggin)所抑制，提示BMP9有特殊的成骨機制[4，10]。BMP9具有成骨功能的I型受體活化素受體樣激酶1、2(ALK1、2)[11]和Ⅱ型受體骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPRⅡ)、激活素Ⅱ型受體(ActRⅡ)[12]已被成功鑒定。在其成骨調控機制研究方面，近年來取得了較多進展。

3.1BMP9成骨信號調控因子

3.1.1正向調控因子

3.1.1.1多毛/增強的分裂相關阻遏蛋白1(hairy/enhancer of split-related repressor protein 1，Hey1) Hey1是堿性螺旋-環-螺旋轉錄抑制劑家族成員之一，是Notch信號途徑的關鍵靶點。Sharff等[13]研究證實Hey1是BMP9介導的MSCs成骨早期上調最顯著的基因之一； 染色質免疫沉淀分析證明Hey1是BMP9誘導的Smad信號通路的直接靶點。增加Hey1表達可增強BMP9誘導成骨分化，而沉默Hey1基因則降低成骨分化能力， 提示Hey1在BMP9誘導的Smad蛋白成骨信號通路中起正調控作用。

3.1.1.2過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ) PPAR-γ是成脂和成骨關鍵的調節因子，可結合脂肪酸衍生物并誘導前體脂肪細胞向終末脂肪細胞分化。Kang等[14]發現過量表達PPAR-γ2可刺激BMP9促進MSCs成骨和成脂分化； 在敲除PPAR-γ2的MSCs中和在PPAR-γ2-/-的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast，MEF)中，BMP-9介導的成脂和成骨作用均減弱，提示PPAR-γ2是BMP9介導的成骨分化作用中的正調控因子。

3.1.1.3DNA結合抑制因子(inhibitor of DNA binding,Id) 與Hey1類似，Id對堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子活性起負調節作用。目前研究表明，DNA結合抑制因子1、2、3(Id-1、2、3)基因在BMP9處理后早期階段顯著上調，3d后降至基礎水平； 利用RNA干擾技術抗默該3種基因或過表達該3種基因，均顯著減弱BMP9誘導的成骨分化[15]。由此可見，Id基因能在BMP9誘導MSCs成骨分化早期階段發揮重要的促進作用。

3.1.1.4結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF) CTGF是即刻早期基因CCN家族成員之一，在骨形成、軟骨細胞成熟和胚胎發育中起重要作用。與Id基因相似，CTGF在BMP9誘導的早期階段表達，5d后降到基礎水平； siRNA介導的CTGF基因沉默和CTGF組成性過表達均消弱BMP9介導的MSCs成骨分化； 外源性表達的CTGF可促進細胞遷移和MSCs的募集，由此推測，CTGF在BMP9介導的MSCs早期成骨分化中可調控成骨祖細胞的增殖和募集[16]。

3.1.1.5缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α) HIF1α是血管生成的重要調節因子，可同時激活血管生成信號和BMP9介導的MSCs成骨信號。BMP9可通過Smad1/5/8信號途徑直接誘導MSCs中HIF1α表達； 外源性的HIF1α過表達能協同BMP9誘導MSCs成骨分化； 而沉默HIF1α基因顯著抑制BMP9介導的成骨，提示HIF1對BMP9的成骨效應具有協同作用[17]。

3.1.1.6環氧酶2(cyclo-oxygen-ase 2,COX-2) COX-2是應激后迅速產生的誘導酶，催化前列腺素(PGs)合成，參與炎癥反應。最近研究表明[18]，COX-2可在BMP9誘導MSCs成骨分化中作為直接靶點上調； 使用COX-2抑制劑NS-398和基因敲除COX-2均可有效減弱BMP9誘導的早、晚期成骨標志物表達及基質礦化； 敲除COX-2基因明顯降低磷酸化Smad 1、5、8蛋白活性，抑制Smad6、Smad7及核心結合蛋白因子2(Runx2)、遠端缺失同源盒5(DLX-5)的表達，從而抑制骨形成。COX-2通過與BMP9形成重要的調節環路在BMP9介導的Smad成骨信號中起著重要調控作用。

3.1.1.7表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF) EGF是一種可刺激表皮和其他多種細胞分裂的蛋白質。EGF增強BMP9誘導早期和晚期成骨標記物表達，但被EGF受體抑制劑吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)及酪氨酸激酶受體抑制劑AG-1478、 AG-494顯著抑制；干細胞移植研究發現EGF可有效增強BMP9誘導的異位成骨； EGF發揮上述作用也是通過調控BMP9誘導的Smad信號通路實現的[19]。

3.1.1.8富含半胱氨酸的表皮生長因子樣蛋白2(cysteine-rich with EGF-like domains protein 2，Creld2) Creld2是定位于內質網-高爾基體的內質網應激誘導因子。全基因組表達譜分析表明Creld2是BMP9刺激MSCs成骨分化中上調最明顯的基因之一； Smad1/5/8以依賴BMP9的方式直接結合Creld2 增強子； 外源性表達Creld2增強BMP9誘導早期和晚期成骨標記物表達、基質礦化及異位成骨； 沉默Creld2基因則出現相反作用。Creld2 可能主要在BMP9介導成骨效應的終末期發揮正調控作用[20]。

3.1.2負向調控因子

3.1.2.1成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2) FGF2可在骨折愈合過程中大量分泌，提示其參與成骨過程。FGF2通過阻斷BMP9誘導的Smad信號，降低依賴Smad的ALK1和ALK2的表達而抑制成骨，這種效應可被外源性表達ALK1和 ALK2所挽救，提示FGF2是BMP9誘導MSCs成骨信號中重要抑制因子[21]。

3.1.2.2組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs) HDACs催化組蛋白的去乙酰化，維系組蛋白乙?；c去乙酰化的平衡狀態。HDACs抑制劑制滴菌素(TSA)可增強BMP9誘導的早晚期成骨標志物表達和基質礦化，擴大軟骨板生長，促進軟骨內骨形成?；贖DACs在MSCs中形成負反饋信號微調BMP9成骨信號的事實[22]，可利用HDAC抑制劑作為骨折愈合的新型療法。

3.2BMP9成骨信號的串擾途徑

3.2.1經典Wnt信號通路 Wnt是成骨細胞分化和骨骼發育中起關鍵作用的分泌型蛋白家族。Wnts結合于卷曲蛋白Frizzled(FRZ)和LRP-5/6共受體從而激活不同的信號通路。Tang等[23]發現，WNT3a和BMP9能增強彼此在MSCs和MEF中誘導堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的能力； Wnt通路拮抗劑FRZB抑制BMP9誘導的ALP活性比分泌型蛋白DKK1的抑制作用更強； FRZB過表達或敲除β-catenin基因，明顯抑制BMP9誘導的體內異位成骨和體外基質礦化。基因芯片技術顯示，BMP9誘導MSCs募集β-catenin和Runx2到骨鈣素的啟動子部位，這可能是成骨信號Wnt與BMP9相互作用的關鍵連接點，二者之間的具體作用機制有待進一步研究闡明。

3.2.2TGF-β1信號通路 TGF-β1信號在骨骼形成、成骨細胞增殖及骨礦化中起重要作用，可增加骨的強度和柔韌性。低濃度的重組TGF-β1(rhTGF-β1)可增強BMP9誘導C3H10T1/2中ALP、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)和I型膠原(collagen type I alpha 2，COL1A2)的表達及基質礦化； 高濃度的rhTGF-β1降低OCN和OPN表達，而不降低COL1A2的表達，提示TGF-β1信號在BMP9誘導MSCs成骨分化中具有劑量相關的雙相調節作用[24]。

3.2.3絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路 目前研究發現，BMP9可磷酸化并激活MAPK主要亞族P38、細胞外調節蛋白激酶2(ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)表達。P38抑制組抑制BMP9誘導的ALP活性和鈣鹽沉積，而ERK1/2抑制組表現出完全相反的作用[25]； JNK抑制劑SP600125和siRNA JNK均抑制BMP9成骨轉錄因子Rux2表達[26]。體內研究還發現[27]，抑制p38減少BMP9誘導成骨，形成薄骨小梁、更多軟骨細胞和大量的間充質祖細胞，而RNAi介導的ERK1/2基因沉默則表現相反，進一步說明p38和ERK1/2可通過Smad信號軸在 BMP9誘導MSCs成骨分化中起相反的調節作用。

3.2.4Notch信號通路 Notch是一種跨膜蛋白，其信號在決定細胞分化和細胞命運中具有至關重要的作用。經AdBMP9處理后,Notch信號通路配體和受體均有不同程度的上調,其中受體Notch4和配體Jag-1上調最明顯，提示Notch信號參與BMP9介導的成骨分化,其機制可能是BMP9誘導Notch信號中配體和受體上調，使Hey1表達升高而協同成骨[28]。

3.2.5生長激素(GH)/ JAK/STAT/IGF1途徑 Huang等[29]發現GH是BMP9過表達時上調最明顯的基因之一，基因芯片技術證實GH是BMP9/Smad途徑直接靶點。外源性表達GH協同BMP9早、晚期成骨作用，而被JAK/ STAT通路抑制劑明顯抑制，且IGF1的表達也被抑制，提示GH可作為BMP9信號的直接靶點，與BMP9協同激活JAK/STAT/IGF1信號通路，有效地促進骨形成。

3.2.6胰島素生長因子2 (IGF-2)/PI3K/AKT信號軸 IGF-2是一種單鏈多肽分子，在胚胎形成和發育中起重要作用。外源性IGF-2表達可增強BMP9誘導的ALP、OPN和OCN活性，促進BMP9介導的骨成型蛋白受體-Smad表達及異位成骨； 而PI3K抑制劑LY294002則通過減弱IGF-2活性抑制BMP9成骨，說明BMP9信號通路可與PI3K/AKT信號中IGF-2耦聯，共同調節MSCs成骨分化[30]。

3.2.7類維生素A(RAs)信號通路 在MSCs中，全反式維甲酸(ATRA)和9 順式維甲酸(9cRA)顯著誘導ALP、OPN和OCN表達并增加基質礦化，AdBMP9過表達可協同上述作用； 體內干細胞移植實驗發現，類維生素A受體a與BMP9在誘導骨小梁和骨樣基質產生中也具協同作用。由此推斷，類維生素A信號能有效增強BMP9誘導成骨分化作用[31]。

3.2.8CXCL12/CXCR4信號軸 趨化因子CXCL12可以在許多組織中表達，對淋巴細胞有強烈的趨化作用，CXCR4是其受體。Liu等[32]最近發現，腺病毒介導的CXCL12/CXCR4預處理C3H10T1/2細胞后，通過激活MAPK-Smad信號通路明顯增強早、中期成骨標志物ALP、骨鈣素，轉錄因子Runx2、Osterix(OSX)、早幼粒細胞白血病鋅指蛋白(PLZF)和DLX5的表達，而不會影響后期的成骨細胞標記物及鈣沉積的變化。CXCL12/CXCR4信號軸可能是BMP9誘導成骨分化的一個先決條件，在早、中期成骨分化過程中起協同作用。

4 結論及展望

BMP9作為目前BMPs家族中成骨能力最強的蛋白，動物實驗證明它在修復骨缺損和促進脊柱融合方面具有良好的臨床應用前景； 其不被BMP3及Noggin所抑制，提示BMP9有特殊的成骨機制。但BMP9成骨信號調控和串擾的具體分子機制及其臨床應用的安全性等問題仍有待進一步深入研究。

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