不同提取方法對茶葉中藥用成分茶多酚含量影響的比較研究

楊勇幫， 牟 娟， 代 慶(.云南省玉溪市食品藥品檢驗所， 云南 玉溪 65300； .大理學院， 云南 大理 675600)

茶是人們日常生活中一種常見的保健飲品，而我國是世界上主要產茶國之一，也是最先發現和利用茶葉的國家[1]。茶葉(Camelliasinensis.L)的藥用價值歷史悠久，歷代藥書中均有茶葉入藥的記載，中國茶書和中醫古籍，對茶的醫療保健作用，都是高度重視和推崇，現存最早的藥物經典《神農本草經》記載：“神農嘗百草，日遇七十二毒，得茶乃解”。唐代陳藏器在《本草拾遺》中說：“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥”。明朝李時珍在《本草綱目》中記載說：“茶苦而寒，最能降火，火為百病之因，火降則百病清也”，顧元慶《茶譜》記載：“飲茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目益思、除煩、去膩，人固不可一日無茶”[2]。近年來，國內外的大量研究表明，茶葉具有抗癌[3]、抗突變[4]、抗衰老、消除自由基[5]、抗氧化[6～7]、降血壓、降血脂[8～9]、降血糖乃至抗艾滋病等多種功效[10]。說明茶具有獨特的藥理作用，該作用是由茶葉中特定的化學成分決定的。研究表明，在這些物質中起主導作用的是一種多羥基酚類物質，即茶多酚(Tea-Polyphenols，簡稱TP)。

茶多酚是一類存在于茶樹中的多羥基酚類化合物的混合物，簡稱茶多酚，俗名茶單寧、茶鞣質。茶多酚純品為白色無定形粉末，易溶于熱水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑，微溶于油脂。難溶于苯、氯仿、石油醚。兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，也是茶葉的特有成分[11～12]。茶多酚中幾種含量較高的兒茶素分別是：左旋-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(L-EGCG)，左旋-表兒茶素沒食子酸酯(L-ECG)，左旋-表沒食子兒茶素(L-EGC)，左旋-表兒茶素(L-EC)。茶多酚是一類具有2-連(或鄰)苯酚基苯并吡喃衍生物，其結構通式如圖1所示。

圖1 四種兒茶素的結構

本文從不同溶劑、不同提取方法等多重影響因素下提取茶多酚，茶多酚的檢測原理是依據《GB/T 8313-2008 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團并顯藍色在波長λ=765nm處有最大吸收峰，用沒食子酸作校正標準定量茶多酚。用紫外-見分光光度法分析測定茶多酚的溶出量，對茶多酚的溶出量進行對比，以期能為茶葉中茶多酚的提取、分析測定有一定幫助。

1 實驗材料與儀器

1.1 主要實驗材料與試劑 市售綠茶與發酵茶樣品；福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑(Sigma-Aldrich公司 F9252)；無水碳酸鈉；沒食子酸對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110931-200302)；水為實驗室自制重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器和設備 島津UV-160A型紫外可見光分光光度計；XMT-DA數顯恒溫水浴鍋；島津AEL-200型電子分析天平；TGL-10B型高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；HU10300F超聲波清洗器(天津恒奧)。

2 實驗方法

2.1 溶液的配制 10%福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑(現配)將20 mL福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑轉移至200 mL容量瓶中，用水定容并搖勻即得。7.5%Na2CO3溶液配制 稱取(37.50±0.01)g Na2CO3，加水適量使溶解，轉移至500 mL容量瓶中，定容至刻度并搖勻即得。沒食子酸標準儲備溶液(1000 ug/mL現配)稱取(0.025±0.001)g沒食子酸(GA，相對分子質量188.14)，于25 mL容量瓶中加水適量使溶解，并定容至刻度，搖勻即得。沒食子酸工作液 用移液管分別移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的沒食子酸標準儲備溶液于100 mL容量瓶中，分別用水定容至刻度，搖勻，10，20，30，40，50 ug/mL。

2.2 供試液的制備

2.2.1 粗茶多酚的提取 精密稱取粉碎后綠茶、發酵茶樣品3.0 g(精確到0.0001 g)，分別加入20 mL溶劑(H2O、70%乙醇、30%乙醇)分別以超聲30 min、加熱回流30 min、溫浸30 min、70℃溫浸24 h、常溫浸提48 h(重復提取3次)提取茶多酚，提取結束后在70℃下蒸干提取劑，即得茶多酚粗提物。

2.2.2 母液的制備 稱取0.2 g(精確到0.0001 g)茶多酚粗提物于10 mL離心管中，加入在70℃中預熱過的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分攪拌均勻潤濕，立即移入70℃水浴中，浸提10 min(隔5 min攪拌1次)，浸提后冷卻至室溫，轉入離心機在3500 r/min轉速下離心10 min，將上清液轉移至10 mL容量瓶。殘渣再用70%甲醇溶液提取1次，重復以上操作。合并提取液定容至10 mL，搖勻，用0.45 um膜，待用。

2.2.3 測試液的制備 移取母液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，待測。

2.3 測定

2.3.1 方法步驟 用移液管分別移取沒食子酸工作液、水(作空白對照用)及測試液各1.0 mL于刻度試管內，在每個試管內分別加入5.0 mL的10%福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑，搖勻。反應4 min后，加入4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60 min。用10 mm比色皿、在765 nm波長條件下用分光光度計測定吸光度(A)。

2.3.2 沒食子酸含量標準曲線的繪制 按測定方法“4.3.1”根據沒食子酸工作液的吸光度(A)與各工作液的沒食子酸濃度，制作標準曲線，結果如圖2。回歸方程為：y=0.1086x+0.0093(R2=0.9987)。

圖2 沒食子酸含量的標準曲線

2.3.3 茶多酚百分含量的計算 計算公式如下：

茶多酚(%)=C(g/mL)×d/m×100%

式中：C：測得的沒食子酸濃度；d：稀釋倍數；m：茶多酚粗提物取樣量。

3 實驗結果

茶多酚粗提物的得率與樣品中茶多酚的含量分別如表2、表3所示：

表2 茶多酚的粗提物得率

表3 樣品中茶多酚的含量

3.1 綠茶與發酵茶提取所得茶多酚溶出量對比，在以上3種提取溶劑和五種提取方式中，綠茶中的茶多酚含量要遠高于發酵茶中的茶多酚含量，而其中尤以超聲和溫浸3次提取出的茶多酚高于其它3種提取方式。

3.2 綠茶與發酵茶超聲提取、加熱回流得率與茶多酚溶出量對比，在兩種提取方式下高濃度乙醇提取出的茶多酚要高于低濃度乙醇和水提取的茶多酚，其中水提出的茶多酚量最少，而兩種提取方式比較下，超聲提取比加熱回流提取的提取率要稍高。

3.3 綠茶與發酵茶70℃溫浸30 min(3次)、70℃溫浸24 h、常溫浸提48 h提取得率與茶多酚溶出量對比，高濃度乙醇提取出的茶多酚較高，低濃度乙醇和水提取的茶多酚溶出量相接近，茶多酚的含量在3種提取方式下未表現出明顯的差異，而以70℃溫浸30 min(3次)提取的茶多酚要略高于其他兩種方法。

4 分析與討論

植物有效成分溶劑提取的原理是：根據植物中各種成分在溶劑中的溶解性質，用對有效成分溶解度大，對無效成分溶解度小的溶劑將有效成分從植物組織中溶出，當溶劑加到植物原料中時，溶劑擴散滲透通過細胞壁進入細胞內，可溶性物質溶解，造成細胞內外的濃度差，以此為推動力使細胞內可溶性物質向溶液主體擴散，至細胞內外有效成分濃度達到動態平衡濾出溶液。

4.1 加大茶多酚的溶出量的措施

4.1.1 增加主體溶液與相界面之間有效成分的濃度差 有效成分濃度差是推動提取進行的主要因素，根據Fick第一擴散定律，濃度差越大，提取的傳質推動力就越大，提取速率就越快，實驗中表現為采用多次重復浸提。

4.1.2 加大材料顆粒與溶劑固液兩相的相對運動 加強兩相間的相對運動，可以減少固相邊界上液膜的厚度降低邊界層阻力，并使液膜不斷更新，從而提高濃度差，增大提取推動力提高傳質速率，實驗中表現為采用超聲波提取。

4.1.3 適當提高提取溫度 對大多數物質而言，升高溫度可以加大物質的溶解度，而且根據Stokes—Einstein 公式可知溫度升高，溶液黏度下降，擴散系數就增大，可提高有效成分的擴散速率，從而提高提取速率，溫度升高，擴散系數增大，但是溫度太高又會使過多的雜質同時提出，或者對熱敏性有效成分有破壞作用，實驗中表現為加熱回流提取和70℃溫浸浸提。

4.2 實驗中涉及提取方法的優缺點

4.2.1 浸漬法提取 該法是將物料粉碎后裝入容器中加入溶劑浸漬物料以溶出有效成分的方法，在常溫下進行，尤其適用于有效成分遇熱易破壞及易揮發的物料，但整個過程處于靜止狀態，提取溫度低，有效成分溶解度和傳質速率小，存在著提取率低，提取周期長，提取液易發霉變質等缺點。

4.2.2 回流提取法 該法是在進行加熱提取時采用循環冷卻裝置，使溶劑連續回流，使植物有效成分充分提出的方法，該法溶劑用量少提取率高，但對于受熱易破壞的成分提取不適用[21]。

4.2.3 超聲波浸提 超聲波浸提是利用超聲波的機械破碎和空化作用，物料周圍空穴形成、增大和閉合回產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎，增加有效成分的溶出速度和數量，加速茶多酚等浸提物從茶葉向溶劑的擴散速度，從而提高了有效成分的浸提率，縮短浸提時間，超聲波浸提的最大優點就是浸提所需的時間短，因此避免了長時間處于高溫下茶多酚的氧化，收率和產品質量都較傳統方法高[11]。

在實驗結果表明，綠茶中提取出的茶多酚要高于在發酵茶中提出的茶多酚，這是由于發酵茶在加工過程中有著一定程度的兒茶素損失。以超聲和加熱回流提取出茶多酚的溶出量比較，二者同樣加大材料顆粒與溶劑固液兩相的相對運動，但加熱回流提取出的茶多酚反而不如超聲提取出的茶多酚，這可能存在的原因是加熱回流過程中的溫度過高，茶多酚受熱氧化損失。又以70℃多次重復提取與70℃溫浸兩種提取方式所得茶多酚比較，多次重復提取所得要高于70℃溫浸，這是多次重復提取法通過多次添加溶劑增加了主體溶液與相界面之間有效成分的濃度差使得茶多酚能通過濃度差盡快的溶于提取溶劑中，加大了提取效率，而70℃溫浸在茶多酚溶出一定量后主體溶液與相界面之間有效成分的濃度差變得極小，茶多酚溶出速度變緩或不繼續溶出，兩種方法比較，多次重復提取耗時短、易操作、提取率高優于70℃溫浸，兩種方法優選多次重復提取。

參考文獻：

[1]劉家紅.茶葉有效成分提取分離技術研究進展[J].南方農業，2010(9)：99-101.

[2]李 睿，帥建軍.茶多酚的分離提取及其性質研究[J].江蘇教育學院學報(自然科學版)，2005，25(4)：26-29.

[3]山根哲郎.醫學漫步[M].東京：日本醫齒藥出版株式會社，2000.194-197.

[4]Oguni I，Nasu K，Kanaya S，et al.Epidemiological and experimental studies on the antitumor activity by green tea Extracts[J].Jpn.J.Nutr，1989，47：93-02.

[5]賈之慎.茶多酚抗氧化作用的研究及應用[J].食品科學，1990，11：1-5.

[6]Okuda T，Mori K，Hayatus H.Inhibitory effect of tannines on direct-acting mutagens[J].Chem Pharm Bull，1984，32：3755-3758.

[7]YoshinoK，TomitaI，SanoM，etal.Effects of long-term dietary supplement of tea polyphenols on lipid peroxide levels in Rats[J].Age，1992，17：79-85.

[8]Khan S G，Katiyar S K，Agarwal R，et al.En-Hancement of antioxidant and phase II enzymes by oralfeeding of green tea[J].CancerRes，1992，52：4050-4052.

[9]Muramatsu K，Fukuyo M，Hara Y.Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol-fed rats[J].J.Nutr Sci Vitaminol，1986，32：613-622.

[10]HaraY，HondaM，The in hibition of-amylase by tea polyphenols[J].Agric Biol Chem，1990，54(8)：1939-1945.

[11]趙衛星，姜紅波，王艷，等.天然抗氧化劑—茶多酚提取、分離和純化方法[J].廣東化工，2010，37(8)：7-8.

[12]李詠梅，王學松，于艷春.茶葉中茶多酚提取方法研究[J].廣州化學，2003，25(1)：59-63.