瑪咖提取物對小鼠運動性疲勞的作用研究

陳 成， 邱明鴻， 馬云淑△， 陳 茹， 馬恒嬌， 黃婷婷(.云南中醫學院， 云南 昆明 650500； .昆明元正生物科技有限公司， 云南 昆明 650500)

疲勞是指由機體運動本身所引起的“機體生理過程不能續持其功能在特定水平和或不能維持預定的運動強度”的機體運動能力下降的現象[1]。主觀上出現疲乏無力等不適感，并導致工作效率的降低。隨著生活節奏的加快、工作壓力的增大，疲勞越來越成為影響人們生活質量的重要因素。因此，延緩疲勞的發生和促進疲勞的恢復一直是醫學界研究的熱點。

瑪咖(LePidiummeyenii，Maca)為十字花科(Cruciferae)獨行菜屬(LePidium)一年生草本植物[2]，原產于海拔3500～4500 m的南美安第斯山區，麗江和會澤兩地因地理環境與原產地相似，種植已獲得成功。瑪咖形似蘿卜的根莖，傳統上作為食物和草藥，用于增強體力、提高精力、調節免疫、改善性功能等[3-8]。現代研究表明，瑪咖含有瑪咖生物堿、芥子油苷和異硫氰酸酯、甾醇及其衍生物和硫氫酸芐及氨基酸類、多糖類、無機元素等多種化學成分[9]。目前對瑪咖的研究與保健品開發方興未艾，國內市場上大部分保健食品多采用瑪咖生粉作為原料，生粉有效成分含量有限，有必要對其去粗取精，減少服用量，增強其保健功能，這也是瑪咖類保健食品開發的關鍵問題之一，本實驗采用麗江引種瑪咖為原料，在經研究確定瑪咖醇水雙提取工藝的基礎上，以瑪咖生粉為對照，考察了瑪咖提取物對小鼠運動性疲勞的影響，為進一步開發利用麗江瑪咖打下基礎。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，SPF級，體重(20±2)g，生產許可證：SCXK(川)2008-24，批號：0016699。適應性飼養1周后進行實驗。動物實驗于云南中醫學院完成。

1.2 儀器 ZDHW調溫電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)；R 10023旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；L-550臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；DFY-800搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；Sartorius BT 25s電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；DY 89-II型電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；80-2臺式低速離心機(山海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠)；WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；秒表；溫度計；灌胃針頭，手術器械。

爬桿器具：自制，直徑1 cm，長25 cm的玻璃棒，砂紙(120目)打磨后上端固定在木板上制成爬桿架，下端懸空，玻璃棒下端距離地面30 cm，地面鋪上2 cm左右的海綿以防止小鼠落下摔傷。

游泳箱：根據《保健食品檢驗程序和方法》要求自制，規格：505040 cm。

1.3 試藥 瑪咖(LePidiummeyenii，Maca，麗江)與瑪咖提取物(均由由昆明元正生物科技有限公司提供)；D-無水葡萄糖標準品(中國藥品生物制品檢定所)；蒽酮(AR，天津大茂化學試劑廠，批號：20130725)；硫脲(AR，中國成都金山化工試劑廠四川，批號：20130605)；三氯乙酸(AR，上海山浦化工有限公司，批號：20130730)；濃硫酸(AR，云南揚林工業開發區汕鎮藥業有限公司，批號：20121221)；生理鹽水(昆明市宇斯藥業有限責任公司，批號：13022201)；無水乙醇(AR，天津大茂化學試劑廠，批號：20130529)；鉛皮(購自漁具店)；5%的三氯乙酸配制：精確稱取5.0 g三氯乙酸，用蒸餾水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，即可；葡萄糖標準溶液配制：使用前先將葡萄糖標準品至于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h，準確稱取100.00 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，制成葡萄糖標準儲備液；蒽酮試劑中含 0.05% 蒽酮，1% 硫脲，用72% 硫酸配制；蒽酮試劑的配制參照文獻[10]。

1.4 瑪咖提取物(醇水雙提物)的制備 瑪咖干燥藥材飲片，將其粉碎成粗粉，稱取粗粉1 kg，加10倍量80%的乙醇回流提取2 h，冷卻，過濾；殘渣再加入8倍量80%的乙醇回流提取1.5 h，冷卻，過濾，濾液與第1次濾液合并，于旋轉蒸發儀上低溫(60℃)回收乙醇，蒸發至干，得醇提物浸膏；殘渣再加入10倍量的水提取2 h，用紗布濾過，濾液經3000 r/min離心15 min，上清液蒸發至干，得水提取浸膏。此法制得醇提物浸膏266.4 g，水提物浸膏70.4 g，將浸膏粉碎混合均勻，得總浸膏336.0 g，即1 g總浸膏相當于2.98 g(約3 g)生藥。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 將昆明種小鼠適應性飼養一周，對其爬桿能力進行初篩后分為5組，即空白對照組、瑪咖提取物高、中、低劑量組和瑪咖生藥粉組。連續灌胃給藥，提取物高、中、低劑量組分別給予提取物3 g·kg-1·d-1(相當于生藥9 g·kg-1·d-1)、2 g·kg-1·d-1(相當于生藥6 g·kg-1·d-1)和1 g·kg-1·d-1(相當于生藥3 g·kg-1·d-1)，原藥粉組給予生藥粉末(過200目篩)3 g·kg-1·d-1，空白組給與等體積的生理鹽水。實驗各組小鼠均自由攝食與飲水。

2.2 小鼠爬桿實驗 對小鼠進行爬桿能力初篩后，棄去不爬桿的小鼠，篩選出爬桿時間相近的小鼠隨機分配到空白組、瑪咖提取物高、中、低組和原藥粉組，每組10只。給藥劑量按方法2.1進行，連續灌胃15 d。末次灌胃給藥30 min后開始實驗。將小鼠放到玻璃棒上，使肌肉處于靜力緊張狀態，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來的時間，第3次跌落時終止實驗，累計3次的時間作為爬桿時間。

2.3 小鼠力竭游泳實驗

2.3.1 小鼠游泳能力初篩 實驗前預先對所有正常小鼠進行力竭游泳篩選，尾根部負荷5%體重的鉛皮，水深30 cm，水溫(25±0.5)℃，記錄小鼠自落水開始至鼻孔沉入水面下5 s不浮出水面的時間作為小鼠游泳時間，篩選出游泳時間相近的小鼠隨機分配到空白組、瑪咖提取物高、中、低劑量組和原藥粉組，每組10只，給藥方式同方法2.1。

2.3.2 小鼠力竭游泳時間測定 各組小鼠喂飼到第15天，灌胃給藥30 min后，置于水溫(25.0±0.5)℃，水深30 cm的游泳箱中5%力竭游泳。為了防止互相擠靠，影響實驗結果，每次放入小鼠5只，在實驗過程中使每只小鼠四肢保持運動，如果小鼠漂浮在水面四肢不動，用玻璃棒在其附近攪動，促進其運動。以小鼠沉入水底，10 s不能浮出水面為溺死指標，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間。

2.4 小鼠運動后肝糖原的測定實驗

2.4.1 葡萄糖吸光度標準曲線的繪制 取6支干凈的試管，分別吸取葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL于各試管中，再分別向各試管中加入1.9、1.8、1.7、1.6、1.5和1.4 mL蒸餾水，使各試管中液體的體積都等于2 mL，然后和實驗組試管進行同樣的操作，測其吸光度，繪制標準曲線。測得的吸光度分別為0.157、0.320、0.463、0.608、0.739和0.894。標準曲線方程為y = 1.4534x + 0.0215，R2= 0.9992。

2.4.2 實驗與肝糖原測定方法 將小鼠適應性飼養一周后，按體重將其隨機分成5組：空白組、瑪咖提取物高、中、低劑量組和原藥粉組，每組10只。按照方法2.1給藥，連續給藥15天，于末次給藥后30 min，在溫度30℃的水箱中不力竭游泳90 min(每箱一次放入5只)，每次入水前均將水溫調至30 ℃，室溫恒定在 25 ℃。 游泳后立即處死取肝。參照文獻[10]測定肝糖原的含量。

3 結果

3.1 瑪咖提取物對小鼠爬桿時間的影響 實驗結果表明，瑪咖提取物低劑量組與空白對照組和瑪咖生藥粉組相比較，均能顯著延長小鼠的爬桿時間(P<0.01)，說明低劑量的瑪咖提取物具有明顯的抗運動性疲勞的作用；而中劑量、高劑量和原藥粉組與空白組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

表1 瑪咖提取物對小鼠爬桿時間的影響

3.2 瑪咖提取物對小鼠力竭游泳時間的影響 游泳試驗結果顯示，瑪咖提取物低劑量組能顯著延長小鼠力竭游泳時間(P<0.01)，而瑪咖生藥粉組與空白組比較，差異無顯著性意義。說明低劑量瑪咖提取物與瑪咖生藥粉相比，具有更好的抗疲勞作用。見表2。

表2 瑪咖提取物對小鼠力竭游泳時間的影響

3.3 瑪咖提取物對小鼠持續運動后肝糖原含量的影響 結果見表3。

表3 瑪咖提取物對小鼠持續運動后肝糖原含量的影響

4 討論

實驗結果顯示，灌胃瑪咖提取物低劑量組的小鼠爬桿時間顯著地高于生理鹽水組(P<0.01)，在力竭游泳試驗中持續游泳時間也較生理鹽水組顯著增長(P<0.01)，持續運動后肝糖原積累含量顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。提示長期服用適當課題中的瑪咖提取物可提高小鼠的運動耐力，延長小鼠的持續運動時間，具有一定的緩解體力疲勞作用。并且瑪咖提取物低劑量組與瑪咖生藥粉組相比較，也能顯著延長小鼠的爬桿時間(P<0.01)和力竭游泳時間(P<0.05)，說明，對麗江引種瑪咖按實驗方法提取后，具有去粗取精、增加其抗運動性疲勞的作用。

本實驗研究還發現，將實驗各組小鼠(每組10只，共50只)繼續飼養到30天后，瑪咖生藥粉組小鼠體重(27.72±2.29)g和瑪咖提取物低劑量組小鼠體重(27.10±1.15)g顯著低于空白對照組(31.31±1.52)g(P<0.01)，而瑪咖提取物中劑量組小鼠體重(30.62±2.80)g和高劑量組的小鼠體重(32.91±3.17)g與空白對照組比較，三組之間的體重差異無顯著性意義。提示連續服用適量的瑪咖或者瑪咖提取物，有控制小鼠的體重的作用。也提示中、高劑量的瑪咖提取物抗疲勞作用不明顯，可能與小鼠體重增長、運動不協調有關。

機體產生疲勞的機制較為復雜[11]，主要包括能源物質耗竭、疲勞物蓄積、自由基增多、中樞神經系統工作能力下降、機體內環境失調等。運動性疲勞可分為軀體性疲勞和心理性疲勞[12]。軀體性疲勞主要表現為運動能力下降，心理性疲勞主要表現為行為的改變。疲勞的評價方法主要有運動耐力實驗和生化改變的檢測。運動耐力是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標。所謂抗疲勞，就是延緩疲勞的產生和/或加速疲勞的消除。運動耐力的測定方法有運動跑臺、爬桿和游泳。運動跑臺有滾筒式和平板式兩種，該裝置較貴，不便于推廣[10]。爬桿裝置簡單，但有的小鼠并非因疲勞落地，而是由于其他主觀原因而放棄抓桿掉落下來的，并且因小鼠趾甲的抓損和桿的光潔度等因素很難保持一致，因此爬桿實驗結果個別組的標準偏差過大，不如游泳試驗結果可靠。但爬桿實驗側重于考察小鼠肌肉對靜態力的持久能力[13]。游泳試驗裝置簡單，且實驗結果能客觀地反映機體的體能，最為常用。

為了系統的評價瑪咖提取物的抗疲勞作用，實驗測定了小鼠運動后肝糖原的含量，體內的糖水平與運動時的耐力密切相關，增加肝糖原含量可以增強機體的抗疲勞能力，肝糖原含量是一個較敏感的指標。實驗發現，瑪咖提取物可促進肝糖原的積累，提示瑪咖提取物可有效改善機體對運動負荷的壓力。

5 小結

實驗中以低劑量的瑪咖提取物所表現的抗疲勞作用最好，過高劑量反而無明顯抗疲勞作用，提示服用適當劑量的瑪咖提取物會有良好的抗疲勞作用。因此，為了弄清瑪咖提取物抗疲勞作用的機理，還需要進行深入的相關實驗研究。

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