Twist基因與乳腺癌關系的研究進展

伏鎧文，肖秀麗

(瀘州醫學院附屬醫院病理科，四川 瀘州 646000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害婦女健康，近年來其發病率呈逐年上升的趨勢，在我國的部分地區已上升至女性惡性腫瘤發病率之首位[1]，并出現發病年齡年輕化的傾向，給乳腺癌的防治提出了挑戰。近期的研究發現Twist基因在胚胎發育、誘導細胞移動及組織塑形中起重要作用，Twist基因異常表達與乳腺癌的發生、侵襲轉移、血管生成及細胞耐藥關系密切。本文就Twist基因與乳腺癌發生發展的關系情況作一綜述。

1 Twist的結構和功能

不同的物種之間，Twist的DNA序列和其蛋白產物的氨基酸序列均呈高度保守特性，而且具有高度的同源性，其中小鼠源Twist和人源Twist氨基酸序列具有96%的相似性[2]。人類Twist基因位于染色體7p21．2，包含2個外顯子和1個內含子，第1個外顯子長為772 bp，內含子長為536 bp，mRNA全長1 669 bp，編碼202個氨基酸組成的Twist蛋白[3]。Twist蛋白分子量約為21kDa，等電點為9.6，氨基末端具有極性親水性，羧基末端無極性相對疏水性[4]。Twist基因是具有編碼堿性的具有螺旋-環-螺旋結構域(basic-Helix-loop-Helix，bHLH)的轉錄因子，屬于bHLH蛋白家族成員[3]。Twist基因在動物胚胎發育及分化過程中起關鍵調控作用，能夠誘導細胞移動及組織塑形，高表達于胚胎期中胚層細胞[5]。

2 Twist與腫瘤相關因子的關系

目前的研究發現，Twist在多種腫瘤中表達上調，Twist通過調控腫瘤相關因子的表達，從而影響腫瘤細胞的凋亡、抑制分化，誘導上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，參與腫瘤的血管生成及腫瘤的耐藥，在腫瘤的發生和發展中起重要作用。

2.1 Twist與P53

p53基因是至今為止發現的與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因[6]，具有調控細胞周期、維持基因組穩定、促進細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等生物學作用。Twist作為轉錄因子可通過p53依賴或非依賴信號通道參與細胞周期及凋亡的調控，Twist的異常表達可以通過阻斷P53腫瘤抑制通道，導致p53介導的細胞周期停滯，同時Twist的異常表達也抑制了P53的促進凋亡作用，導致腫瘤細胞的形成[7]。以往的研究證實p53發生突變后，發生癌變的概率將顯著提升，在人類約75%的癌中均發現突變p53蛋白[8]。近年來對乳腺癌的研究發現Twist基因與P53基因啟動子上的HOXA5相互結合，共同調節P53上游調控因子讀碼框蛋白(alternative reading frame，ARF)的表達，阻止p53翻譯后的修飾，導致P53的失活，從而促進腫瘤細胞形成[9-10]。

2.2 Twist與VEGF

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認為是最重要的血管生成因子之一，它能夠促進血管內皮細胞的生長和增殖。腫瘤血管生成在腫瘤的發生發展、侵襲轉移和復發中具有重要作用，惡性腫瘤細胞的持續生長必須依賴于新生血管的形成，才能提供足夠的營養和氧，帶走代謝產物；VEGF在大多數惡性腫瘤均表達增加，并誘導腫瘤新生血管生成，改變新生血管通透性，促進腫瘤細胞進入血液，轉移到遠處組織[11]。Mironchik等[12]研究發現，用Twist轉染乳腺癌MCF-7細胞系后VEGF的合成增加，接種Twist表達陽性的MCF-7細胞系到嚴重免疫缺陷小鼠體內，構建移植瘤模型，通過功能性磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，FMRI)分析，發現腫瘤的血管容量增加且血管通透性增高，血管生成加快，腫瘤增大明顯。Gerecht-Nir等[13]通過對人胚胎發育血管形成相關基因之一的VEGF表達的研究，也發現有Twist基因的表達上調。這些研究結果表明了Twist的異常表達可以促進VEGF的合成，與惡性腫瘤的生長轉移密切相關。

2.3 Twist與E-cadherin和N-cadherin及EMT

眾多研究表明EMT是腫瘤進展的重要步驟[14]，EMT的主要細胞學改變表現為上皮細胞失去極性及細胞間的粘附性、細胞骨架發生改變、細胞移動能力增加等，這些過程與上皮黏附素(E-cadherin)向神經黏附素(N-cadherin)轉換密切相關[15]。 E-cadherin表達下調被認為是EMT的標志事件，而N-cadherin上調是細胞獲得運動遷徙能力的顯著標志。Twist基因作為轉錄因子通過對 E-cadherin和 N-cadherin表達的調節誘導了MET的發生[16]。而在乳腺患者癌中，Twist過量表達與其靶基因E-cadherin下調及N-cadherin上調顯著相關，Twist能抑制E-cadherin的啟動、促進EMT在腫瘤發病機制中扮演重要的角色[17]。Hennessy等[18]將人永生化乳腺上皮細胞(HMLE)經EMT誘導，獲得的間質腫瘤細胞具有干細胞特征，Twist在內的各種EMT的誘導因素使乳腺癌干細胞表現出自我更新能力和多向分化能力，具有明顯的進展期的乳腺癌細胞的特性，揭示了Twist及EMT有利于惡性腫瘤細胞脫離原發病灶，發生遠處轉移，促進繼發性腫瘤的產生。Vesuna等[19]培養能穩定過量表達Twist的人乳腺癌細胞系(MCF-7/Twist)，發現Twist的過量表達誘導了EMT，而且有部分染色體發生異常和畸變，這也可能是腫瘤惡性程度增加，侵襲力增強的原因之一。

3 Twist與乳腺癌的關系

Yang等[20]通過對小鼠乳腺腫瘤細胞系體內和體外的系列實驗研究，分析比較基因表達圖譜發現：①Twist的異常表達與乳腺癌的侵襲和轉移相關；②利用RNA干擾技術抑制乳腺癌細胞中Twist的表達，結果顯示乳腺癌肺轉移的數量與速率顯著下降；③Twist結合到E-cadherin啟動子區的E-box序列抑制其轉錄，導致E-cadherin介導的細胞間的粘附作用降低，同時誘導產生多種間充質標志物和增強了癌細胞的侵襲能力。根據這些研究結果和已知的Twist在胚胎期的調控作用，可以推測Twist能夠通過EMT促進乳腺癌的侵襲轉移。

近年來發現信號轉導子與轉錄激活子3 (signal transducer and activator of transcription3，STAT3)也參與了乳腺癌的進展。Ling等[21]利用RNA干擾技術沉默STAT3的表達，觀察小鼠體內乳腺腫瘤的生長狀態，發現在敲除STAT3的細胞中Twist不表達，乳腺癌細胞的增殖率保持不變，而侵襲能力顯著降低。該研究表明STAT3可以通過誘導Twist的表達，促進乳腺癌的轉移。另一項針對乳腺癌的研究發現Twist基因啟動子存在STAT3的結合位點，STAT3可以通過該結合位點調控Twist的轉錄，STAT3的活化增加了Twist的表達，而抑制STAT3的活性則Twist的表達將顯著降低，將導致乳腺癌細胞的遷徙、侵襲和集落形成能力的減弱[22]。Cheng等[23]發現Twist可以誘導產生蛋白激酶Bβ(protein kinases，PKBβ，又稱AKT2)，增加了細胞的致癌性，指出STAT3、Twist和AKT2形成一個功能信號軸參與乳腺癌細胞的侵襲和轉移。以上研究表明STAT3 和Twist的表達水平之間存在強相關性，活化STAT3可以誘導Twist的表達，從而促進乳腺癌細胞的生長、浸潤和轉移。

一些微小RNA可能參與了乳腺腫瘤的轉移，Ma等[24]研究發現microRNA-10b(miR-10b)在轉移性乳腺癌細胞中高表達并調節其遷移和侵襲。Twist轉錄因子通過直接結合到miR-10b增強子來啟動miR-10b的表達，而miR-10b又能抑制編碼homeobox D10的翻譯，從而導致轉移基因—RhoC的表達增加。同時也發現，在原發性乳腺癌中miR-10b 的表達水平與臨床進展關系密切。基于上述研究結果，可以推測Twist通過調控miR-10b的轉錄間接增加了RhoC的表達，從而促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。

Eckert等[25]證明了血小板衍生生長因子受體α(platelet derived growth factor receptor-α，PDGFRα)是Twist的直接靶基因，Twist通過誘導PDGFRα的生成激活Src激酶，從而促進乳腺癌細胞侵襲性偽足的形成，這種偽足能降解細胞外基質，是導致惡性腫瘤侵襲性生長的關鍵結構，因此Twist間接誘發侵襲性偽足的形成被認為是乳腺癌細胞侵襲轉移的一種新的機制。

4 Twist與乳腺癌的診斷及治療

長期以來，組織病理學診斷是腫瘤診斷的“金標準”和臨床治療的基礎。近年來的許多文獻報道提示在不同的腫瘤類型和分期中，Twist的表達具有顯著的差異性，例如何春年等[26]研究發現，Twist基因在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)中的陽性表達率為100%，其靈敏度、特異度和準確度分別為100%，94.0%和78.0%，遠高于對照組的濾泡狀腺瘤(follicular adenomas，FA)和良性乳頭病變(benign papillary lesions，BPL)，因此認為Twist可用于輔助診斷PTC，并可應用在對FA或BPL的鑒別診斷。Liu 等[27]研究發現，胃癌組織與正常胃組織中的Twist陽性表達率分別為93.9%和2.9%。Twist在鼻咽癌和鼻咽部黏膜組織的表達率也具有差異性[28]。這些學者的研究為我們提供了腫瘤診斷和鑒別診斷新的思路，即是否可以利用Twist在良惡性病變中的表達差異性，將其作為一種新的診斷和鑒別診斷的分子標志物，是否可以應用到乳腺癌診斷以及不同亞型乳腺癌之間的鑒別診斷？肖雄升等[29]做了相應的嘗試，研究了三種惡性程度不同乳腺癌細胞中Twist基因和及其蛋白的表達情況，結果顯示隨著轉移程度的增高Twist的表達也明顯增高，由此提示可以通過檢測乳腺腫瘤組織中的Twist基因及其蛋白表達水平初步判斷乳腺癌細胞的惡性程度及轉移潛能，為臨床評判乳腺癌的轉移、分期和選擇綜合治療方案提供佐證。

化療是治療乳腺癌的重要策略，可以減少腫瘤的復發轉移，有效提高乳腺癌患者總生存率和無病生存率，但與之伴隨的腫瘤多藥耐藥性(multi drug resistance，MDR)的不斷出現，從很大程度上影響了腫瘤的藥物治療，是導致乳腺癌患者化療失敗的主要原因之一。近年來的研究表明，Twist 在促進腫瘤進展的過程中，不僅能夠抑制凋亡和通過EMT促進腫瘤轉移，還能促進腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥現象[30]。Vesuna等[19]通過對人類多種乳腺癌細胞株的研究發現，在不同癌細胞株中Twist表達水平均不相同，且Twist表達水平高的乳腺癌細胞株較Twist表達低水平的乳腺癌細胞株對紫杉醇的耐藥性強，在腫瘤細胞耐藥相關基因激活導致發生耐藥的同時，伴隨著轉移相關信號通路的激活，從而導致轉移相關基因的表達增高，促進了轉移的發生。另外，癌細胞的侵襲能力與多藥耐藥性之間存在著相關性，但具體機制尚不明確。Cheng等[31]研究發現，乳腺癌細胞中Twist上調Akt2的表達，抑制細胞凋亡，癌細胞的移動侵襲能力和對紫杉醇的耐藥性將會增加，進一步通過RNA干擾技術證實AKT2是Twist下游的功能性調節介質，Twist-AKT2信號不僅可以增強癌細胞的侵襲能力，而且對抗癌藥物產生耐藥性也發揮重要作用。李軍林等[32]對乳腺癌MCF-7/Twist穩定表達細胞株的多藥耐藥性研究，結果發現穩定表達Twist的細胞株對阿奇霉素、紫杉醇、長春新堿和羥喜樹堿具有明顯的耐藥性，耐藥相關分子P糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)轉錄和表達明顯上調。以上研究表明Twist的表達增強了乳腺癌細胞的多藥耐藥性，可能通過調控PGP和BCRP的表達，影響抗癌藥物的攝取和外排。

越來越多的研究表明腫瘤治療后復發的根源在于腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)的存在，CSCs具有自我更新、分裂增殖能力、DNA修復活性和耐藥等特性，而其耐藥性使CSCs能抵抗化療藥物的作用，因此，CSCs被認為是造成腫瘤耐藥的最根本原因[33]。Li等[34]通過對乳腺癌MCF-7和宮頸癌Hela細胞的研究發現，Twist的表達上調可誘導與EMT相關的細胞形態學變化，導致癌細胞出現干細胞樣特征，如腫瘤球的形成以及表達CD44和ALDH等干細胞標志物，并且推測Twist誘發EMT后，癌細胞產生耐藥性是由于癌細胞具有了干細胞樣特性。Banerjee等[35]研究發現ARTN可以維持細胞的干細胞樣特性，促進了乳腺癌細胞的化療藥物耐藥性和放療輻射抵抗性，Twist通過調節ARTN蛋白的表達，對維持癌細胞的干細胞特性及其耐藥性發揮重要作用。

5 結語

綜上所述，Twist的異常表達，與乳腺癌的發生、發展、浸潤、轉移以及腫瘤的耐藥性關系密切，可以幫助臨床醫生對乳腺癌的早期診斷、治療、預后及有無復發轉移做出更準確的判斷。但是我們對Twist的生物學特性和在乳腺癌發生發展過程中的機制仍未完全明確，有待進一步研究。在現有研究的基礎上，以Twist為重要診斷分子標志物和基因靶點的治療將可能成為乳腺癌治療的又一重要研究方向。因此，對Twist功能的進一步研究可能為乳腺癌及其他惡性腫瘤的治療翻開新的篇章。

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