一株雞源嗜鉛乳酸菌的篩選鑒定

姜彥君等

摘要：試驗目的是從肉雞的腸道內容物及排泄物中篩選出具有鉛抗性的細菌，用于重金屬鉛的去除。采用涂布平板技術從采集的樣品中共分離篩選到8株具有較好鉛抗性和吸附性的菌株，其中JT1菌株對鉛的抗性（800 mg/L）和去除能力 （66.95%）最高。通過培養特征、形態觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析等方法證明，所得JT1菌株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。該菌株可以在10～45℃、pH 4.5～9.6、6.5%NaCl溶液、0.8%膽鹽、0.1%胰蛋白酶濃度條件下生長良好。

關鍵詞：雞；重金屬；鉛；乳酸菌

中圖分類號：Q939.92文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）02-0072-06

由于人為因素（農業、工業及軍事作業）影響，重金屬對環境的污染越來越嚴重，近幾年已逐步成為全球問題。重金屬是生物體非必需元素，對植物、動物都具有毒性。由于重金屬的非生物降解性和永久存在性，很容易在土壤、植物以及水生植物和動物中積累，從而導致其濃度在食物鏈中不斷放大[1]。

在有害重金屬中，鉛（Pb）和鎘（Cd）是最主要的污染物，可以引起多種生物有機體的功能障礙，通過食物鏈進入人體后，可引起各種疾病，例如鎘會引起骨軟化、肺癌、腎癌、心血管系統和生殖系統紊亂[2]，鉛會損壞中樞神經系統、降低記憶力、影響兒童的智力發育和骨骼生長[3]。

研究顯示，已有利用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等細菌和真菌清除水體環境中重金屬的報道，且效果顯著[4]。迄今尚未見從環境及動物體內分離篩選具有重金屬抗性乳酸菌的報道。本試驗從肉雞腸道中分離和鑒定出具有鉛抗性的細菌，并對其16S rDNA序列進行了分析，為進一步將其作為金屬清除益生菌添加到動物飼料或食品中奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料和儀器

培養基：MRS液體培養基：蛋白胨10 g，乙酸鈉5 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，磷酸氫二鉀2 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，檸檬酸二銨2 g，吐溫-80 1 ml，蒸餾水1 000 ml，pH 5.4～5.6，115℃滅菌30 min；MRS固體培養基：MRS液體培養基中加入1.4%瓊脂；改良MRS固體培養基：MRS固體培養基中加入5%碳酸鈣；LB肉湯；營養瓊脂。

試劑：乙酸鉛（AR）；碳酸鈣；Tris；EDTA；十二烷基硫酸鈉；NaCl；酚/氯仿/異戊醇：（25∶24∶1）。

儀器： 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海市精宏 DHG-9036A；高壓蒸汽滅菌鍋：鳥取三洋電機（廣州）有限公司； 精密pH計：德國賽多利斯股份公司；水浴恒溫振蕩器：金城國勝實驗儀器廠；電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司；原子吸收分光光度計；高速冷凍離心機；PCR儀；電泳儀；凝膠成像設備。

1.2試驗方法

1.2.1樣品的采集于2011年從山東省日照市果莊肉雞養殖場及青島農業大學動物科技學院實驗基地無菌采集糞便樣品。菌株篩選試驗在青島農業大學食品風險分析實驗室進行，以MRS固體培養基作為分離培養基。

1.2.2耐性菌株的馴化、篩選稱取5.0 g新鮮樣品，在無菌條件下將其放入裝有適量玻璃珠和45 ml無菌生理鹽水的錐形瓶中，37℃、140 r/min 振蕩30 min后稀釋至10-3、10-4、10-5，各吸取0.1 ml分別涂布于含有100、200、400、800 mg/L Pb2+的MRS固體平板上，37℃培養，于24、48 h時觀察平板上細菌的生長狀況[5]。將篩選出的耐鉛菌株逐步在含更高鉛濃度的培養基上接種培養，從而獲得目的菌株。將獲得的優勢耐鉛菌株在含200 mg/L Pb2+的培養基上分離純化，最終獲得單一菌株并保存（甘油管保存法）。

1.2.3菌株穩定性的測定將獲得的優勢菌株在含200 mg/L Pb2+的MRS固體培養基上連續傳代多次，觀察其對鉛的耐受性是否發生變化，從而判斷其穩定性[6]。

1.2.4耐性菌株的吸附鉛試驗將獲得的優勢菌株離心后的濕菌體加入10 ml含20 mg/L Pb2+的LB液體培養基中，振蕩吸附后，12 000 r/min離心5 min，取上清液定容至50 ml，測定Pb2+的濃度，重復3次。以加大腸桿菌為對照，以不加菌為空白對照。

1.2.8JT1菌株生長特性研究

①生長曲線的測定：將活化好的JT1菌株按1%的接種量接入MRS液體培養基中，37℃搖床培養，每隔4 h取樣一次，用分光光度計測定菌液的OD600值，用未接種的MRS液體培養基作為空白對照，以培養時間為橫坐標，測定的相應OD600值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線[10]。

②酸耐受試驗：將活化好的JT1菌株按1%接種量分別接種于pH值3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5的MRS液體培養基中，37℃培養18 h測定OD600，以pH值為橫坐標，測定的相應OD值為縱坐標，繪制曲線。

③膽鹽耐受試驗：取活化后JT1的菌株0.1 ml分別接種于含0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%膽鹽的MRS液體培養基中，37℃培養24 h，稀釋適當的倍數后，進行涂布，觀察生長狀況[11]。

④消化酶耐受試驗：按1%接種量接種于含0.1%（W/V）胰蛋白酶的MRS液體培養基中，以不添加胰蛋白酶的MRS培養基為對照，37℃培養，0、8 h時各取樣一次，稀釋適當倍數進行平板計數，計算存活率。

⑤抑菌性試驗：選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌作為測試菌株，分別取100 μl菌液涂布于營養瓊脂平板上，用直徑為7 mm的無菌圓形濾低在JT1菌株發酵液中充分浸泡，等距離擺放于平板上，37℃倒置培養24 h，量取抑菌圈直徑大小，測定菌株的抑菌性。endprint

2結果與分析

2.1耐性菌株的馴化、篩選及穩定性測定

在含不同鉛濃度的MRS固體培養基中對樣品進行篩選，獲得耐鉛能力較強的菌株，再將耐鉛菌株在相同鉛濃度的培養基上進行分離純化，最終得到8株優勢耐鉛菌株JT1～JT8，其中JT1耐鉛濃度最高，達800 mg/L。經過多次傳代培養后，該8株菌株的耐鉛性表現穩定，未發生顯著變化，說明經過多次傳代后沒有基因丟失，具有較高的、穩定的重金屬耐受性。

2.2耐性菌株吸附鉛試驗

不加菌的空白對照鉛的測定值為4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株處理后鉛的測定值及吸附率見表2。由表2可以看出，與大腸桿菌相比，篩選馴化出的菌株對Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，為66.95%，具有一定的研究價值。

2.3JT1菌株Pb2+吸附的影響因素

2.3.1pH值由圖1可知，在一定Pb2+濃度的溶液中，pH值較低時，JT1菌體對Pb2+吸附率較低，但隨著pH值的升高，吸附率也升高，當pH值上升到6.5時，吸附率達到56.663%，pH值繼續升高，吸附率基本保持穩定。因此，JT1菌株吸附重金屬鉛時的最佳pH值為6.5。

3討論

通過形態、生理生化特征及16S rDNA序列測定[14]，鑒定本試驗所篩選的雞源耐鉛細菌JT1為E. faecium。重金屬抗性、去除能力、抑菌性等特性顯示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，體外鉛吸附率達66.95%，同時可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長，因此可以作為益生菌添加到飼料中，用以去除動物體內的重金屬，控制重金屬在動物體內的長期積累[15]，保障動物性食品的安全，從而確保人類的安全[16]。其具體吸附機理及體內吸附性能還需進一步的研究。

參考文獻：

[1]Jarup L. Hazard of heavy metal contamination[J].Br. Med. Bull.，2003， 68（1）：167-182.

[2]王文仲，徐兆發.鎘的腎臟毒理學[J].中國工業醫學雜志，2001，14（5）：291-293.

[3]顏崇淮， 沈曉明. 中國兒童鉛中毒防治研究的回顧和展望[J]. 中華預防醫學雜志， 2008， 42（3）： 147-150.

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[5]段學軍，閔航.一株抗鎘細菌的分離鑒定及其抗性基因定位的初步研究[J].環境科學學報， 2004，24（1）：154-158.

[6]曹小紅，楊亞靜，魯梅芳，等. 耐鉛、銅微生物的篩選及吸附性能研究[J].環境保護科學， 2008，34（5）：15-17.

[7]HalttunenT， Salminen S， Tahvonen R. Rapid removal of lead and cadmium from water by specific lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology， 2007，114（1）：30-35.

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[9]許光勝，王喜亮，吳濤，等.豬源糞腸球菌的分離、鑒定及應用[J].中國獸醫學報， 2012，32（11）：1645-1650.

[10]羅雅，蔣代華，夏穎，等.一株耐鉛細菌J3的篩選分離及其生物學特性[J].南方農業學報， 2011，42（9）：1041-1044.

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[12]Sheng P X， Ting Y， Chen J P. Biosorption of heavy metal ions （Pb， Cu and Cd） from aqueous solutions by the marine alga Sargassum sp. in single-and multiple-metal systems[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research， 2007， 46（8）：2438-2444.

[13]趙嬌， 趙蕾. 一株促生拮抗木霉菌的鑒定[J]. 山東農業科學， 2013， 45（4）： 86-89.

[14]李方正，唐亮，趙建文，等. 一株高效秸稈纖維素降解真菌的分離、鑒定及系統發育分析[J]. 山東農業科學， 2011， 7： 5-8.

[15]葛龍，李波.屎腸球菌在飼用微生態制劑中的研究與應用[J].飼料與畜牧， 2013，6：57-59.

[16]Marcussen H， Holm P E， Dalsgaard A. Food safety aspects of toxic element accumulation in fish from wastewaterfed ponds in Hanoi[J]. Trop. Med. Int. Health， 2007， 12（2）：34-39.endprint

2結果與分析

2.1耐性菌株的馴化、篩選及穩定性測定

在含不同鉛濃度的MRS固體培養基中對樣品進行篩選，獲得耐鉛能力較強的菌株，再將耐鉛菌株在相同鉛濃度的培養基上進行分離純化，最終得到8株優勢耐鉛菌株JT1～JT8，其中JT1耐鉛濃度最高，達800 mg/L。經過多次傳代培養后，該8株菌株的耐鉛性表現穩定，未發生顯著變化，說明經過多次傳代后沒有基因丟失，具有較高的、穩定的重金屬耐受性。

2.2耐性菌株吸附鉛試驗

不加菌的空白對照鉛的測定值為4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株處理后鉛的測定值及吸附率見表2。由表2可以看出，與大腸桿菌相比，篩選馴化出的菌株對Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，為66.95%，具有一定的研究價值。

2.3JT1菌株Pb2+吸附的影響因素

2.3.1pH值由圖1可知，在一定Pb2+濃度的溶液中，pH值較低時，JT1菌體對Pb2+吸附率較低，但隨著pH值的升高，吸附率也升高，當pH值上升到6.5時，吸附率達到56.663%，pH值繼續升高，吸附率基本保持穩定。因此，JT1菌株吸附重金屬鉛時的最佳pH值為6.5。

3討論

通過形態、生理生化特征及16S rDNA序列測定[14]，鑒定本試驗所篩選的雞源耐鉛細菌JT1為E. faecium。重金屬抗性、去除能力、抑菌性等特性顯示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，體外鉛吸附率達66.95%，同時可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長，因此可以作為益生菌添加到飼料中，用以去除動物體內的重金屬，控制重金屬在動物體內的長期積累[15]，保障動物性食品的安全，從而確保人類的安全[16]。其具體吸附機理及體內吸附性能還需進一步的研究。

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2結果與分析

2.1耐性菌株的馴化、篩選及穩定性測定

在含不同鉛濃度的MRS固體培養基中對樣品進行篩選，獲得耐鉛能力較強的菌株，再將耐鉛菌株在相同鉛濃度的培養基上進行分離純化，最終得到8株優勢耐鉛菌株JT1～JT8，其中JT1耐鉛濃度最高，達800 mg/L。經過多次傳代培養后，該8株菌株的耐鉛性表現穩定，未發生顯著變化，說明經過多次傳代后沒有基因丟失，具有較高的、穩定的重金屬耐受性。

2.2耐性菌株吸附鉛試驗

不加菌的空白對照鉛的測定值為4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株處理后鉛的測定值及吸附率見表2。由表2可以看出，與大腸桿菌相比，篩選馴化出的菌株對Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，為66.95%，具有一定的研究價值。

2.3JT1菌株Pb2+吸附的影響因素

2.3.1pH值由圖1可知，在一定Pb2+濃度的溶液中，pH值較低時，JT1菌體對Pb2+吸附率較低，但隨著pH值的升高，吸附率也升高，當pH值上升到6.5時，吸附率達到56.663%，pH值繼續升高，吸附率基本保持穩定。因此，JT1菌株吸附重金屬鉛時的最佳pH值為6.5。

3討論

通過形態、生理生化特征及16S rDNA序列測定[14]，鑒定本試驗所篩選的雞源耐鉛細菌JT1為E. faecium。重金屬抗性、去除能力、抑菌性等特性顯示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，體外鉛吸附率達66.95%，同時可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長，因此可以作為益生菌添加到飼料中，用以去除動物體內的重金屬，控制重金屬在動物體內的長期積累[15]，保障動物性食品的安全，從而確保人類的安全[16]。其具體吸附機理及體內吸附性能還需進一步的研究。

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[13]趙嬌， 趙蕾. 一株促生拮抗木霉菌的鑒定[J]. 山東農業科學， 2013， 45（4）： 86-89.

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