羽毛降解菌的分離及多樣性分析

賈嘉元等

摘要：從禽肉加工廠的污泥中分離到174株能在牛奶瓊脂平板產(chǎn)透明圈微生物菌株，其中42株具有分解羽毛的能力，從中篩選出13株具有較強(qiáng)羽毛降解能力的菌株，均能在48 h內(nèi)將羽毛完全分解。16S rDNA的BLAST比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示，8株菌為寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），1株菌為芽孢桿菌屬（Bacillus），4株菌為氣單胞菌屬（Aeromonas）。

關(guān)鍵詞：羽毛降解菌；16S rDNA；發(fā)育樹

中圖分類號(hào)：Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）02-0068-04

羽毛是養(yǎng)殖業(yè)的廢棄物，但同時(shí)又是一種很好的飼料蛋白原料和化工資源。我國每年的羽毛總量超過100萬噸[1]，而且隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，產(chǎn)量逐年增加。羽毛主要成分是角蛋白質(zhì)，其半胱氨酸形成高度交聯(lián)的二硫鍵，難以被普通蛋白水解酶分解，如果不經(jīng)過處理動(dòng)物很難消化和利用[2]。常規(guī)處理羽毛的方式為酸堿水解或高溫高壓蒸煮，耗能高而且易引起嚴(yán)重環(huán)境污染。自然界中的某些微生物能分泌角蛋白酶將角蛋白質(zhì)緩慢分解，因此篩選具有高效分解羽毛能力的微生物一直是該領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)工作。自然環(huán)境中降解角蛋白的微生物普遍存在，包括真菌、細(xì)菌和放線菌等[2～5]。近年來，隨著人們對(duì)羽毛類廢棄物資源循環(huán)利用價(jià)值認(rèn)識(shí)的深入，越來越多的羽毛分解菌被分離純化培養(yǎng)，從而為羽毛分解機(jī)制研究及其開發(fā)利用提供越來越豐富的微生物資源。但未見典型環(huán)境條件下降解羽毛微生物多樣性及優(yōu)勢(shì)種群的報(bào)道。

本研究從家禽屠宰廠污泥池典型環(huán)境取樣，篩選分離具有羽毛降解能力的微生物菌株，通過16S rDNA的BLAST比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行微生物多樣性分析，為研究羽毛降解機(jī)理和微生物資源開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品及菌株分離

樣品采集于山東六和平度屠宰廠污泥沉淀池。取5 g污泥樣品，加到裝有95 ml滅菌水和玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，做成懸液；將上清液梯度稀釋，100 μl涂布牛奶平板，30℃ 倒置培養(yǎng)36 h；挑取水解圈比較大的菌落點(diǎn)接牛奶固體平板；挑取牛奶平板上水解圈較大的菌落接種到含有羽毛粉液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min、30℃搖床培養(yǎng)，篩選能降解羽毛粉的菌株。將具有分解羽毛粉能力的菌株接種到含有完整羽毛的三角瓶中（培養(yǎng)條件同上）進(jìn)一步篩選，觀察羽毛降解情況。牛奶瓊脂培養(yǎng)基和羽毛粉液體培養(yǎng)基的配制參見黃亦鈞等（2009）[6]的方法。

1.2菌株、質(zhì)粒和材料

細(xì)菌和質(zhì)粒見表1。E. coli菌株于LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)。安芐青霉素終濃度為100 μg/ml。T-載體、Taq酶和T4 DNA連接酶均購自大連TaKaRa公司；DNA Marker、Pfu酶和DNA回收試劑盒均購自北京全式金公司。

3結(jié)論與討論

本研究從家禽屠宰廠污泥沉淀池這一典型環(huán)境中分離到174株產(chǎn)蛋白酶的菌株，利用羽毛培養(yǎng)進(jìn)一步篩選，得到42株具有羽毛分解能力的菌株，說明了特定環(huán)境下功能微生物的聚落（cluster）特點(diǎn)。對(duì)其中分解羽毛能力強(qiáng)的13株菌進(jìn)行16S rDNA序列分析，BLAST比對(duì)結(jié)果表明，8株（61.5%）屬于寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），4株屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），1株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），說明該環(huán)境中分解羽毛的微生物存在一定程度的多樣性及優(yōu)勢(shì)種群。

系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，SDK02、SDK03、SDK04、SDK05、SDK06、SDK07、SDK08、SDK09與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌親緣關(guān)系最近。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬于革蘭氏陰性原核微生物，是一類條件致病菌[10]，已有關(guān)于該菌具有分解羽毛能力及角蛋白酶基因克隆的報(bào)道[11，12]；而且S. maltophilia 能分解有毒化合物和高分子的多環(huán)芳香烴[13，14]，也是潛在的生物殺蟲劑和環(huán)境修復(fù)微生物資源。菌株SDK12與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系最近，可歸為枯草芽孢桿菌。枯草芽孢桿菌屬于應(yīng)用廣泛的益生菌，其降解羽毛的機(jī)理和發(fā)酵代謝均有報(bào)道[1，15，16]。菌株SDK01、SDK10、SDK11、SDK13為殺鮭氣單胞菌，目前尚未見該類菌具有降解羽毛功能的研究報(bào)道，是一類新的有待研究與開發(fā)的微生物資源。

致謝：黃亦鈞博士、許麗紅碩士為本研究做了部分實(shí)驗(yàn)工作，在此表示感謝。

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