普萘洛爾治療增殖期血管瘤患者血管內皮生長因子-A及表皮生長因子樣結構域7的表達分析

凌彬 陳曼麗 劉潔 尹小朋 林兆全 龔忠誠

1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科；2.新疆醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學研究所，烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830000

嬰幼兒血管瘤（infantile hemangioma）是胚胎期血管形成過程中出現的一種先天性發(fā)育不良，多見于出生時或出生后不久，是嬰幼兒時期最常見的良性腫瘤[1]，發(fā)病率為5%～10%，在早產兒中可高達30%[2]。Léauté-Labrèze等[3]于2008年首次報道了使用普萘洛爾治療多例嬰幼兒血管瘤取得了顯著的療效，然而其治療機制至今尚不完全明確。

表皮生長因子樣結構域（epidermal growth factorlike domain，EGFL）7由Soncin在2003年發(fā)現，是定位于人類9號染色體上的一個內皮特異性基因，在胚胎發(fā)育過程的內皮細胞及內皮祖細胞中表達[4]。EGFL7是血管管腔發(fā)育過程中的一個關鍵基因，其表達降低可直接引起血管管腔的發(fā)育障礙[5]。增殖期血管瘤中血管內皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）及其他促血管生成因子刺激內皮細胞大量增殖，EGFL7通過調節(jié)內皮細胞的黏附，引導內皮細胞遷徙，維持了血管正常的空間結構，同時內皮細胞上表達的EGFL7阻止平滑肌細胞的遷出，保證了腫瘤血管的穩(wěn)定性，在其共同作用下，血管瘤得以快速增殖。本研究旨在對臨床應用普萘洛爾治療嬰幼兒增殖期血管瘤患者VEGF-A、EGFL7的變化進行檢測，探討其可能的治療機制及對治療的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

以2005年中華醫(yī)學會發(fā)布的《口腔頜面部血管瘤及脈管畸形的診斷和治療指南（草案）》[6]作為診斷標準，收集2010年8月—2013年2月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院頜面腫瘤外科收治的30例嬰幼兒增殖期血管瘤患者為研究對象。30例患者中，男性10例，女性20例；年齡2～11個月，平均8個月；漢族17例，維吾爾族8例，回族3例，蒙古族2例；頜面部27例，軀干2例，四肢1例。研究中納入的嬰幼兒血管瘤瘤體直徑至少大于1 cm。參與研究的患者在采集血樣本之前均未接受過任何治療。

本研究經新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，在治療與實驗前所有患者的監(jiān)護人均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 治療方法

患兒入院后完善血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能、心電圖、血壓、血糖檢查。對于各項檢查符合要求的患兒口服普萘洛爾（天津力生制藥廠生產，批號H12020151）。口服藥物的治療方案基于前期臨床研究[7]進行了優(yōu)化：小于3個月的患者口服劑量為每天0.5 mg·kg-1；3～6個月大小的患者口服劑量為每天1 mg·kg-1；大于6個月的患者口服劑量為每天2 mg·kg-1。每次服藥前、服藥后0.5、1、2、3 h監(jiān)測心率、血壓。

當患者出現以下情況時不能服藥：急性炎癥（如急性上呼吸道感染、氣管炎、肺炎等）、血小板功能異常、哮喘、竇性心動過緩、房室傳導阻滯、嚴重或急性充血性心力衰竭、心源性休克或肝、腎功能異常等疾病；血糖、甲狀腺功能有異常者；接受手術和激光治療者；年齡大于12月者；藥物過敏史合并其他先天性疾病者；資料不完整者、不配合治療者和不簽署知情同意書者。

藥物在需進食時服用。開始口服普萘洛爾后所有患兒入院觀察3～5 d。患兒出院后，在父母或監(jiān)護人指導下給予口服普萘洛爾。療程持續(xù)4～8個月，如果患兒血管瘤完全消退或整個療程達到8個月則停止服用藥物。

所有患兒在出院后定期隨訪。隨訪時患兒給藥劑量根據患兒體重的變化進行調整。

1.3 臨床療效評價

治療前和治療后12周通過B超測量瘤體的層次、大小、血運、邊界。根據B超得出的瘤體大小，采用國際上公認的Achauer療效評定法[8]進行臨床療效評估。Ⅰ級（差）：瘤體縮小<25%；Ⅱ級（中等）：瘤體縮小 26%～50%；Ⅲ級（好）：瘤體縮小 51%～75%；Ⅳ級（優(yōu)）：瘤體縮小>75%。

1.4 治療前后血清及尿液中VEGF-A和EGFL7表達的測定

分別抽取每例患者服用普萘洛爾前、服藥后4周和12周外周靜脈血2 mL、尿液5 mL。血液樣本放置于無菌離心管中室溫下靜置60 min，采用轉速為2 000 g·min-1離心機離心10 min分離血清。離心后的血清樣本凍存于?80 ℃，避免反復凍存和融化。采用相同方法處理尿液標本。所有樣本在室溫下解凍，VEGF-A試劑盒由eBioscience公司提供，EGFL7試劑盒由CUSABIO（CSB-E15864h）公司提供。采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清和尿液中VEGF-A、EGFL7的含量，具體步驟參照說明書進行。

1.5 統計學分析

選用Excel軟件進行數據錄入，SPSS 17.0軟件進行統計分析。組間比較采用兩因素方差分析（檢驗水準α=0.05，P<0.05表示有統計學差異），兩兩比較采用LSD法比較。治療效果采用Ridit方法分析，將有序等級資料轉化成連續(xù)型資料（R值），轉化后采用單因素方差分析F檢驗。在F值有意義的情況下，再進行多組間兩兩比較的LSD檢驗。對VEGF-A與EGFL7，VEGF-A、EGFL7與給藥時程的關系進行BIVARIATE相關性分析。

2 結果

2.1 臨床療效

整個治療過程中均未出現明顯副作用，無1例患者退出治療。首次治療24 h后多數血管瘤瘤體顏色變淺并且質地變軟，其中1例患者服用普萘洛爾3個月后瘤體完全消退。

治療效果評價： 2例（17%）優(yōu)，11例（46%）好，14例（29%）中等，3例（9%）差。總有效率為90%（27/30）。

不同性別、民族、部位的血管瘤患者間的治療效果均無統計學差異（P>0.05）。治療后4周與治療后12周的治療效果有統計學差異（P<0.05），治療后12周治療效果優(yōu)于治療后4周，說明隨著治療時間的延長，治療效果越來越顯著。治療后4周不同血管瘤分型（淺表型、混合型、深部型）的治療效果無統計學差異（P>0.05）；治療后12周不同血管瘤分型（淺表型、混合型、深部型）的治療效果有統計學差異（P<0.05）（圖1），隨著治療時間的延長，深部或混合型血管瘤的治療效果優(yōu)于淺表型血管瘤。

2.2 治療前后血清及尿液中VEGF-A的表達

治療前后血清及尿液中VEGF-A的表達見表1。治療前血清VEGF-A水平最高（335.692 pg·mL-1±136.146 pg·mL-1），治療后4周（264.853 pg·mL-1±122.120 pg·mL-1）和治療后12周（211.345 pg·mL-1±104.035 pg·mL-1）呈現逐漸下降的趨勢，治療后4、12周的血清VEGF-A水平低于治療前（P<0.05）。治療前尿液VEGF-A水平最高（76.234 pg·mL-1±24.169 pg·mL-1），治療后4周（56.454 pg·mL-1±16.111 pg·mL-1）和治療后12周（34.728 pg·mL-1±12.656 pg·mL-1）呈逐漸下降趨勢，治療后4、12周，尿中液VEGF的表達水平較治療前明顯降低，其差異有統計學意義（P<0.05）。

圖1 不同治療時間、血管瘤分型的治療效果的Ridit分析Fig 1 Ridit analysis of therapeutic effect of different treatment time and type of hemangioma

表1 治療前后血清及尿液中VEGF-A和EGFL7的表達Tab 1 The expression of VEGF-A and EGFL7 in serum and urinary before and after treatment pg·mL-1

2.3 治療前后血清及尿液中EGFL7的表達

治療前后血清及尿液中EGFL7的表達見表1。治療前血清EGFL7水平最高，治療后4周和12周EGFL7水平呈逐漸下降趨勢，低于治療前（P<0.05）。治療前尿液EGFL7水平最高，治療后4周和12周EGFL7水平呈逐漸下降趨勢，低于治療前（P<0.05）。血清和尿液中EGFL7的表達趨勢與VEGF-A一致。VEGF-A和EGFL7水平兩兩比較，具有統計學差異（P<0.05）。

2.4 VEGF-A與EGFL7的相關性分析

相關性分析表明，血清VEGF-A與EGFL7不相關（r=-0.082，P>0.05），尿液VEGF-A與EGFL7呈正相關（r=0.657，P<0.05）。

2.5 VEGF-A、EGFL7與給藥時程的相關性分析。

血清及尿液中的VEGF-A、EGFL7含量與給藥時程均呈負相關關系，隨著給藥時間的延長，血清及尿液中的VEGF-A和EGFL7含量逐漸減少（P<0.05）（表2）。

表2 VEGF-A、EGFL7與給藥時程的相關性分析Tab 2 Correlation analysis between VEGF-A,EGFL7 and administration time

3 討論

本研究對治療效果分析發(fā)現，患者的性別、民族、治療部位與患者的治療效果無關；治療時間越長，治療效果越好；血管瘤的分型與治療效果密切相關，隨著治療時間的延長，深部型或混合型血管瘤的治療效果優(yōu)于淺表型血管瘤。特別值得注意的是，普萘洛爾對腮腺區(qū)較大的深部血管瘤具有明顯療效，此類病變治療后明顯縮小，而相對于表淺的侵犯皮膚的血管瘤，其治療效果欠佳。治療過程中無1例患者退出治療。大多數血管瘤在首次治療后24 h瘤體顏色變淺并且質地變軟。治療過程中均無明顯副作用。患者家長對治療效果滿意。其中1例患者服用普萘洛爾3個月后瘤體完全消退。然而，有些瘤體在患兒突然停藥后復發(fā)，通過繼續(xù)服用藥物治療能有效地控制增殖，因此停藥時需告知家長緩慢停藥。

VEGF是最重要的一種血管生成調節(jié)因子，能有效地促進血管內皮細胞的增殖。在內皮細胞系統中，VEGF可以特異性地作用于VEGF受體，刺激內皮細胞增殖，增加血管的通透性，促進腫瘤血管的生長。

EGFL7基因是由Soncin等[4]的實驗室首先發(fā)現的一個在血管內皮特異性表達的基因，EGFL7屬于分泌型蛋白，包含兩個生長因子類似的結構域。EGFL7存在于細胞的內質網和高爾基體，通過分泌至內皮細胞附近，可能與細胞間基質有關[9]。Parker等[5]在研究中發(fā)現，EGFL7涉及血管形成過程中成管這一關鍵性的步驟，在生理性和病理性血管的管腔形成、功能完善上發(fā)揮著重要作用，其表達改變將影響血管的新生。另有研究[10]表明，在血管增生過程中，EGFL7通過促進內皮細胞的遷移和黏附，使內皮細胞與細胞間質的結合及局部遷移受到協調控制，通過進一步調節(jié)血管生成組織或內皮細胞的逐漸分離和恰當的空間排列，導致血管管腔形成。EGFL7在促進血管內皮遷徙、調節(jié)內皮細胞黏附以及抑制血管平滑肌遷徙等構建血管床結構和保持血管穩(wěn)定中起著重要作用，但是EGFL7并不能刺激內皮細胞的增殖[9-11]。

Campagnolo等[12]研究認為，EGFL7可作為一個化學趨化性物質刺激、增強細胞的運動遷移能力。化學趨化物介導細胞定向趨化運動的同時，也可通過G蛋白偶聯受體激活下游信號傳導通路，調節(jié)細胞的形態(tài)學改變。RAS/MAPK通路的激活等可增強細胞運動遷移能力[13-14]，最終可導致血管內皮遷移活躍，血管新生增加。

血管形成是一個復雜但有序的嚴格調節(jié)的過程，分子間發(fā)生了復雜的相互作用，涉及多種可溶性因子及其受體。血管內皮細胞、血管壁細胞與細胞基質的接觸也參與血管生成過程[15-16]；因此，形成一個局部穩(wěn)定和有功能的血管結構，最終取決于這些復雜的相互反應。EGFL7是血管管腔形成所必需的，高水平的EGFL7表達與血管增生和重塑有關[5]。EGFL7基因是血管管腔發(fā)育過程中的關鍵基因，與VEGF在血管形成中的作用明顯不同，前者表達降低可以直接引起血管管腔的發(fā)育障礙，而后者則使內皮細胞的增生性能明顯降低，間接地影響了血管的發(fā)育。

VEGF基因的轉錄受到多種細胞因子如堿性成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、腫瘤壞死因子、轉化生長因子等的調節(jié)。這是因為VEGF基因啟動子序列中相對于轉錄起始位點的50～96 bp區(qū)域為G-C豐富區(qū)[17]，此啟動子區(qū)域包含轉錄因子SP-1/SP-3、早期生長反應因子1及AP-2結合位點。推測EGFL7亦可能通過與特定的轉錄子SP-1、SP-3或與VEGF啟動子結合，從而調控VEGF基因表達。

蔣衛(wèi)東等[18]研究顯示，EGFL7亦可能與其他的血管生長因子通過相同的信號通路相互影響，這與內皮細胞的活性有關。他們發(fā)現人臍靜脈內皮細胞株的EGFL7基因被有效沉默后，三磷酸腺苷和乳酸脫氫酶等的檢測結果均顯示人臍靜脈內皮細胞株的存活率受到了一定程度的影響，EGFL7可能是一種內皮細胞存活或活性維持的重要基因，一旦其基因沉默，內皮細胞活性降低，VEGF等生長因子表達水平降低。

本研究中也發(fā)現，在服用普萘洛爾治療4周及12周后，患者血清及尿液的VEGF及EGFL7表達量明顯減低，兩者呈同步下降的趨勢，符合正調控關系。出現這種現象可以認為普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤起效，其可能的機制是通過降低EGFL7的表達，使EGFL7對VEGF基因轉錄的調控作用減弱，導致VEGF轉錄水平受到抑制，VEGF表達減少，從而使血管新生活力下降，通過間接作用于血管內皮細胞使得血管瘤瘤體變小。這些細胞因子之間可能還存在一些其他的通路或相關因子的調控作用，這尚需進行進一步的實驗來明確普萘洛爾成功治療血管瘤的機制。

[1]陸陽,張文杰,李偉.嬰幼兒血管瘤發(fā)病機制的研究進展[J].中國美容醫(yī)學,2009,18(6):874-876.

[2]Mulliken JB,Fishman SJ,Burrows PE.Vascular anomalies[J].Curr Probl Surg,2000,37(8):517-584.

[3]Léauté-Labrèze C,Dumas de la Roque E,Hubiche T,et al.Propranolol for severe hemangiomas of infancy[J].N Engl J Med,2008,358(24):2649-2651.

[4]Soncin F,Mattot V,Lionneton F,et al.VE-statin,an endothelial repressor of smooth muscle cell migration[J].EMBO J,2003,22(21):5700-5711.

[5]Parker LH,Schmidt M,Jin SW,et al.The endothelial-cellderived secreted factor Egf l7 regulates vascular tube formation[J].Nature,2004,428(6984):754-758.

[6]中華口腔醫(yī)學會口腔頜面外科專業(yè)委員會脈管性疾病學組.口腔頜面部血管瘤及脈管畸形的診斷和治療指南（草案）[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2005,40(3):185-186.

[7]龔忠誠,凌彬,克熱木,等.普萘洛爾治療 24 例嬰幼兒血管瘤的臨床觀察[J].實用口腔醫(yī)學雜志,2013,29(4):594-597.

[8]Achauer BM,Vander Kam VM.Vascular lesions[J].Clin Plast Surg,1993,20(1):43-51.

[9]Fitch MJ,Campagnolo L,Kuhnert F,et al.Egf l7,a novel epidermal growth factor-domain gene expressed in endothelial cells[J].Dev Dyn,2004,230(2):316-324.

[10]Schmidt M,Paes K,De Mazière A,et al.EGFL7 regulates the collective migration of endothelial cells by restricting their spatial distribution[J].Development,2007,134(16):2913-2923.

[11]Rossant J,Hirashima M.Vascular development and patterning:making the right choices[J].Curr Opin Genet Dev,2003,13(4):408-412.

[12]Campagnolo L,Leahy A,Chitnis S,et al.EGFL7 is a chemoattractant for endothelial cells and is up-regulated in angiogenesis and arterial injury[J].Am J Pathol,2005,167(1):275-284.

[13]Vicente-Manzanares M,Sánchez-Madrid F.Role of the cytoskeleton during leukocyte responses[J].Nat Rev Immunol,2004,4(2):110-122.

[14]Rossi D,Zlotnik A.The biology of chemokines and their receptors[J].Annu Rev Immunol,2000,18:217-242.

[15]Levéen P,Pekny M,Gebre-Medhin S,et al.Mice def icient for PDGF B show renal,cardiovascular,and hematological abnormalities[J].Genes Dev,1994,8(16):1875-1887.

[16]Witzenbichler B,Maisonpierre PC,Jones P,et al.Chemotactic properties of angiopoietin-1 and -2,ligands for the endothelial-specif ic receptor tyrosine kinase Tie2[J].J Biol Chem,1998,273(29):18514-18521.

[17]陳治,張莉.VEGF 基因表達調控機制的研究進展[J].國外醫(yī)學:生理病理科學與臨床分冊,2000,20(3):190-192.

[18]蔣衛(wèi)東,曾季平,劉玉勝,等.類表皮生長因子域7與動脈粥樣硬化斑塊內血管生成關系[J].中華老年醫(yī)學雜志,2012,31(1):39-43.