人骨形態發生蛋白2真核表達載體構建及其基因/殼聚糖納米復合體制備

楊曉喻 李世軼 張迪 吳穎 楊濤 劉長虹

南方醫科大學附屬口腔醫院·廣東省口腔醫院種植中心，廣州 510280

種植體表面良好的處理，有利于盡快實現骨整合，從而履行功能。以往的種植體表面處理研究主要集中在種植體表面的物理化學處理，而基因水平的生物化學處理較為少見。人骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有獨特的誘導成骨活性[1]。其中，BMP2的誘導成骨活性最強，可促進Ca、P在鈦金屬表面沉積，提高種植體-骨界面結合率，加快骨結合進程。殼聚糖（chitosan，CS）[2]作為一種非病毒載體，是自然界中唯一一種帶陽離子的可降解納米級載體，具有良好的生物相容性、可降解性和黏膜黏附性，特別適合包載蛋白質、多肽、疫苗和基因等生物活性大分子[3-5]。本研究利用基因重組技術在體外構建人BMP2基因的真核表達重組質粒，并采用去溶劑法合成殼聚糖/質粒納米復合體，為后續基因轉染形成活性因子激活成骨信號通道以加快種植體周成骨的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

pMD18T-hBMP2-His（帶有組氨酸標簽的人骨形態發生蛋白2模板質粒，北京義翹神州生物技術公司），p IRES2-EGFP（攜帶有增強型綠色熒光蛋白的真核表達載體，含卡那霉素抗性基因，Clontech公司，美國），感受態大腸桿菌DH5α（Promega公司，美國），限制性內切酶（Takara公司，日本），T4 DNA連接酶（NEB公司，美國），質粒抽提試劑盒（Qiagen公司，美國）， DNA引物合成及測序（Invitrogen公司，美國），核酸蛋白分析儀（Implen公司，德國），ZetaPALS電位及粒度分析儀（Brookhaven公司，美國），原子力顯微鏡MFP-3D（Asylum Research公司，美國）。殼聚糖：A組（相對分子質量98.8×103，脫乙酰度87.31%）、B組（相對分子質量121×103，脫乙酰度91.48%）、C組（相對分子質量77.8×103，脫乙酰度97.37%）（上海卡博工貿有限公司），D組（相對分子質量379×103，脫乙酰度93.9%）（Sigma公司，美國），E組（相對分子質量17×103，脫乙酰度79%）（日本慶應大學實驗室提供）。

1.2 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質粒的構建、鑒定及測序

1.2.1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質粒的構建p IRES2-EGFP和pMD18T-hBMP2-His雙酶切及目的片段回收：取p IRES2-EGFP載體質粒和經PCR擴增并加載雙酶切位點的pMD 18T-hBMP2-His質粒經BamHⅠ、EcoRⅠ在37 ℃水浴雙酶切反應2 h，切取目的條帶，分別將含目的片段的瓊脂糖凝膠經DNA純化回收試劑盒回收。

p IRES2-EGFP-hBMP2-His真核表達重組質粒的構建：取經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的pIRES2-EGFP大片段以及經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切的目的基因hBMP2-His片段加入T4 DNA連接酶，22 ℃反應2 h。

連接產物轉化：轉化入感受態細菌DH5α中，取100 μL均勻涂布于含50 μg·m L-1卡那霉素的LB平板上，室溫放置涂好的平板直至液體被完全吸收，37 ℃恒溫培養箱倒置培養過夜，可見菌落出現。

1.2.2 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質粒的鑒定及測序 挑取菌落進行搖菌擴增，質粒抽提試劑盒提取質粒。質粒經EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，0.6%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，25 m in）鑒定。陽性克隆可酶切出1 209 bp大小的片段。將鑒定正確的重組克隆送Invitrogen公司進行測序驗證，測序引物為通用引物CMV-F。在www.ncbi.nlm.nih.gov上通過BLAST程序對所測得序列與GenBank的BMP2基因同源序列進行比較。

1.3 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的制備及檢測

1.3.1 去溶劑法制備CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體 分別稱取一定量的5種不同相對分子質量及脫乙酰度的殼聚糖（A～E組），溶解于體積分數為1%的乙酸，使終濃度為0.2 mg·m L-1，NaOH溶液調節pH至6.5，0.22 μm濾膜過濾，置于4 ℃冰箱待用。p IRES2-EGFP-hBMP2-His質粒溶于20%的Na2SO4溶液。按N/P（殼聚糖中的胺基含量與質粒中磷酸基含量的摩爾比）=1、3、5、7、10分別將55 ℃預熱殼聚糖與pIRES2-EGFP-hBMP2-His混合，渦旋30 s，靜置30 m in，即為CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體混懸液。

1.3.2 CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的粒徑及Zeta電位檢測 取N/P=3、5、7、10的納米復合體懸液，用1%pH 6.5乙酸溶液稀釋納米復合體至適當濃度及體積，ZetaPALS電位及粒度分析儀檢測納米復合體的粒徑大小、分布及Zeta電位。

1.3.3 CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體凝膠電泳實驗及包封率測定 取裸質粒DNA及不同N/P比值（N/P=1、3、5、7、10）納米復合體懸液10 μL，行0.6%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，25 m in）分析。

取C組200 μL pH6.5殼聚糖按照N/P=5與pIRES2-EGFP-hBMP2-His反應形成納米復合體，低溫離心30 m in（4℃，15000 g）。小心吸取上清液，TNE緩沖液（1.21 g Tris，5.84 g NaCl，0.37 g EDTA，定容至1 L，pH=7.4）定容至1 m L，再加入濃度為0.15 μg·m L-1的Hoechst33258染液1 m L，熒光分光法測定熒光強度（F），根據標準曲線公式計算溶液中質粒DNA濃度（c），按下式計算包封率 ：包封率（%）=（W總-W上清) /W總×100% ，其中W總為總pDNA 量，W上清為上清液中pDNA量。重復實驗3次，取平均值。

1.3.4 CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體形貌觀察 取N/P=5的CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體懸液，滴于新剝離的云母片上，分散均勻，過夜使其自然干燥，原子力顯微鏡觀察納米復合體的形貌。設置空白云母片組及N/P=10組作為對照。

2 結果

2.1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質粒的鑒定以及測序

p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質粒經EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，可見載體片段（5 308 bp）及目的基因片段（1 209 bp），酶切結果正確（圖1），表明經轉化、擴增、抽提后的質粒為目的質粒。經基因序列測定及分析后未見突變，p IRES2-EGFP-hBMP2-His重組質粒與GenBank的BMP2基因同源序列的比較表明，與人BMP2基因具有高度同源性。

圖1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His經EcoRⅠand BamHⅠ雙酶切Fig 1 p IRES2-EGFP-hBMP2-His plasm id digested by EcoRⅠand BamHⅠ

2.2 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體粒徑大小、分布及Zeta電位檢測

不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的粒徑大小見表1。從表1可見，5組殼聚糖在不同N/P比情況下均能與p IRES2-EGFP-hBMP2-His質粒復合形成納米復合體，粒徑111.7～3 214.2 nm不等，A、B、C組在N/P≥5時及D、E組在每個N/P比情況下均可以形成兩種不同粒徑大小的納米復合體。納米復合體的粒徑主要集中在兩個區域范圍，形成兩個峰值，粒徑較小的納米復合體數量較多，粒徑較大的復合體數量較少（圖2）。

表1 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體粒徑的大小Tab 1 Size of CS/p IRES2-EGFP-hBM P2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups±s,n=10, nm

表1 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體粒徑的大小Tab 1 Size of CS/p IRES2-EGFP-hBM P2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups±s,n=10, nm

圖2 C組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體粒徑的分布（N/P=5）Fig 2 Distribution of CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles of group C（N/P=5）

5組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的Zeta電位4.93～16.79 mV不等（表2），并且，隨著N/P比的增加，納米復合體表面Zeta電位呈上升趨勢且趨于穩定。

表2 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體表面Zeta電位大小Tab 2 Zeta potential of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups , n=10, m V±s

表2 不同N/P比值下各組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體表面Zeta電位大小Tab 2 Zeta potential of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles under various N/P ratio in different groups , n=10, m V±s

2.3 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的包封率測定

不同N/P比值的納米復合體凝膠電泳分析結果見圖3。當N/P≥3時，殼聚糖對p IRES2-EGFP-hBMP2-His完全包裹。C組CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的標準曲線方程為F=224.66c+239.43，包封率為（96.03±0.25）%。

圖3 不同N/P比值的CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體凝膠電泳分析Fig 3 Agarose electrophoresis of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles at different N/P ratios

2.4 CS/pIRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體的形貌

原子力顯微鏡下可見，空白云母片呈均勻狀，背景較為清晰（圖4A）；N/P=5時，殼聚糖與p IRES2-EGFP-hBMP2-His質粒復合后形成球狀的CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體結構（圖4B）；N/P=10時，球狀的納米復合體部分聚集形成較大的聚集體（圖4C）。

圖4 不同N/P比值的CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His納米復合體形貌的原子力顯微鏡觀察Fig 4 Morphology of CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His nanoparticles by atomic force microscope

3 討論

目的基因要在轉染真核細胞內表達，首先取決于目的基因真核表達載體的構建[6]。p IRES2-EGFP作為基因表達的載體，復制能力強，具有多克隆位點，便于目的基因片段插入，并且含有高效且功能強大的CMV啟動子，可以使目的基因在多種類型細胞中穩定表達活性。此外，該載體攜帶增強型綠色熒光蛋白基因，當攜帶外源性基因進入細胞內，細胞轉錄翻譯基因產生綠色熒光蛋白，該蛋白強度較普通綠色熒光蛋白強幾十倍，有利于鏡下觀察檢測分析目的基因的轉染效率。由此可見p IRES2-EGFP具有生物活性、無細胞毒性、不影響融合蛋白表達、熒光效果穩定、檢測方便的優點。

在基因治療中，攜帶靶基因的載體復合體粒徑是基因微粒分散遞送系統的一個重要影響因素，可以直接影響分散系統在細胞表面的吸附、吞噬及胞內釋放。小于100 nm的粒子不易黏附于細胞表面，較大粒徑的微粒因組織擴散和入胞受限影響轉染效率，而100～300 nm范圍內的納米微粒相對來說較容易通過細胞的胞吞作用進入胞內，從而釋放目的基因作用于靶細胞[7]。

殼聚糖與目的基因的結合通常采用共價交聯法、離子誘導法等[8]，本研究中殼聚糖與p IRES2-EGFP-hBMP2-His質粒復合形成納米復合體采用的是去溶劑法。該方法合成工藝簡單，條件溫和，不會破壞基因和蛋白質，且制備的納米粒徑小，穩定性較好。弱酸性溶液中的殼聚糖部分質子化呈帶正電荷狀態，當加入帶有負電荷的p IRES2-EGFP-hBMP2-His時，二者通過靜電作用結合形成納米復合體，并由于溶液Na2SO4電解質的存在，使得高分子物質從溶液中析出，最終形成納米粒。在殼聚糖與質粒基因進行復合的時候，存在一定的N/P比，即殼聚糖中的胺基與基因中磷酸基的摩爾比。當殼聚糖與質粒按照N/P=1復合時，加入殼聚糖的量不足以與所加入的質粒量充分結合，遂導致凝膠電泳時游離的質粒在電泳槽中由負極向正極移動，而當N/P≥3時，殼聚糖攜帶的正電荷對質粒基因有完全捕獲能力[9-11]。

此外，本實驗中在測定各組納米復合體粒徑大小時發現，相對分子質量17×103～379×103、脫乙酰度79%～97.31%的殼聚糖在N/P≥3的情況下均可以與目的質粒結合形成納米粒。在納米復合體粒徑檢測中發現，每組粒徑分布幾乎都會出現雙峰，其中主峰粒徑較小，數量較多，這在以往文獻中未見報道。該雙峰現象是因為殼聚糖與基因復合過程中，納米微粒帶表面電荷，并且受到微粒在溶液中布朗運動的影響，一些粒徑較小的納米微粒在溶液中呈不穩定狀態，在團聚效應作用下形成較大粒徑的復合體。

殼聚糖/DNA納米復合體的構建受多種因素如相對分子質量大小、脫乙酰度、pH值、N/P比等的影響[12-15]，探討CS/p IRES2-EGFP-hBMP2-His的構建工作具有重要的意義。今后的研究將進一步探索影響殼聚糖作為基因載體的多項因素，并進行細胞轉染的生物實驗，以驗證和檢測殼聚糖作為基因載體的生物安全性以及轉染效率，研究如何對殼聚糖進行改性或接枝以及模擬種植體表面的生物界面，為種植體周圍快速成骨提供基礎研究。

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