S180瘤株對動(dòng)物模型體內(nèi)荷瘤的影響及致瘤機(jī)制

遲淑萍 張?jiān)婟?陳紅鴿劉 軍 杜 麗孫 杰 蔣正杰 程 云▲

1.解放軍第三〇二醫(yī)院藥學(xué)部研究室，北京100039；2.解放軍空軍后勤部衛(wèi)生防疫隊(duì)，北京100005

S180瘤株對動(dòng)物模型體內(nèi)荷瘤的影響及致瘤機(jī)制

遲淑萍1張?jiān)婟?陳紅鴿1劉 軍1杜 麗1孫 杰1蔣正杰2▲程 云1▲

1.解放軍第三〇二醫(yī)院藥學(xué)部研究室，北京100039；2.解放軍空軍后勤部衛(wèi)生防疫隊(duì)，北京100005

目的通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察S180瘤株對小鼠荷瘤形成的影響，探討S180肉瘤細(xì)胞的致瘤機(jī)制。方法建立小鼠實(shí)體瘤模型，將昆明系小鼠36只，按體重隨機(jī)分為3組，每組12只。空白組：每日灌胃給予蒸餾水，0.2mL/ 10 g體重；模型組：皮下接種S180肉瘤細(xì)胞，制成小鼠實(shí)體瘤模型，其后每日口服灌胃1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液；環(huán)磷酰胺組：皮下接種S180肉瘤細(xì)胞，制成小鼠實(shí)體瘤模型后，注射0.02 g/（kg·d）環(huán)磷酰胺注射液。觀察各組腫瘤生長情況，計(jì)算平均重量；與模型組比較，環(huán)磷酰胺組計(jì)算腫瘤生長抑制率；采用蛋白免疫印跡法技術(shù)方法，檢測抑癌基因P53、P21及凋亡抑制基因Bcl-2在S180腫瘤動(dòng)物模型瘤體組織中的蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組小鼠荷瘤成功，與空白組比較，模型組小鼠出現(xiàn)腫瘤，其瘤重為（1.513±0.790）g，環(huán)磷酰胺組瘤重為（0.248±0.253）g，兩組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），環(huán)磷酰胺抑瘤率為83.63%。在被檢瘤體中，三種蛋白表達(dá)空白組與模型組、空白組與環(huán)磷酰胺組相比差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，模型組P53、P21抗體的蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，P21表達(dá)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Bcl-2變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.66）。結(jié)論S180肉瘤細(xì)胞可能通過抑制P53與P21的表達(dá)而起到促進(jìn)腫瘤形成的作用，該機(jī)制的研究可為篩選腫瘤治療藥物及腫瘤機(jī)制探討等的腫瘤動(dòng)物模型提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

S180；蛋白免疫印跡法；P53；P21；Bcl-2

腫瘤是當(dāng)前危害人類健康最主要的疾病之一，惡性腫瘤更是威脅生命的殺手。人類醫(yī)學(xué)在對抗腫瘤的戰(zhàn)爭中，做了大量的科學(xué)研究工作，其中最基本的就是腫瘤細(xì)胞模型與腫瘤動(dòng)物模型的建立。Foley等[1]在1956年建立了可移植性小鼠S180腫瘤細(xì)胞株，將其注入CFW小鼠腹腔內(nèi)保種傳代。自細(xì)胞系建立以來，被廣泛用于篩選腫瘤治療藥物及腫瘤機(jī)制探討研究，同時(shí)荷S180小鼠也成為最常用的腫瘤動(dòng)物模型之一[2]。由于S180瘤細(xì)胞株及其腫瘤動(dòng)物模型在醫(yī)學(xué)研究上具有重要的作用，因此，其在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制亟待深入探究。本研究旨在通過建立腫瘤動(dòng)物模型，觀察腫瘤相關(guān)基因在腫瘤形成中的作用，以期在抗腫瘤動(dòng)物模型研討中減少和控制實(shí)驗(yàn)誤差。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑環(huán)磷酰胺購自山西普德藥業(yè)有限公司（批號(hào)20070310）；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo（批號(hào)JL128100）；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司，發(fā)光試劑盒購自Thermo公司，P53、P21、Bcl-2多克隆抗體、二抗均購自Santa公司。

1.1.2 動(dòng)物與瘤株昆明種健康小鼠，清潔級(jí)（2級(jí)），雌雄各半，體重（20±2）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為：scxk-（軍）-2007-004；小鼠S180腹水瘤株為解放第三〇二醫(yī)院藥學(xué)部研究室保存。

1.1.3 儀器酶聯(lián)儀型號(hào)為ZS-3，由北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司制造；電子天平型號(hào)為SPN202F，購自梅特勒-托利多常州稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠實(shí)體瘤模型的建立取健康昆明系小鼠6只，雌雄各半，腹腔注射液體石蠟油0.5 mL/只，7 d后腹腔接種S180細(xì)胞，0.5 mL/只，9 d左右見小鼠腹部漲大，按之有波動(dòng)感后，斷頸處死，無菌條件下分別取出腹水，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次后制成細(xì)胞懸液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠分組和給藥取小鼠36只，按體重隨機(jī)分為3組即空白組、模型組、環(huán)磷酰胺組，每組12只，6只/籠。除外空白組，小鼠右腋皮下接種S180細(xì)胞懸液，0.1mL/只，制成小鼠實(shí)體瘤模型[3]。空白組：每日口服灌胃生理鹽水（NS），0.5 mL/只；模型組：接種腫瘤細(xì)胞后，每日口服灌胃1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液，0.5 mL/只；環(huán)磷酰胺組：接種腫瘤細(xì)胞后，每日注射環(huán)磷酰胺注射液0.02 g/（kg·d）[4]，連續(xù)10 d，第11天測量小鼠體重并眼球取血，斷頸處死后留取腫瘤組織，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠實(shí)體瘤瘤體的獲取三組小鼠經(jīng)10 d連續(xù)給藥后，在末次給藥之后的24 h，經(jīng)測量全部小鼠的體重后頸椎脫臼處死并且解剖，分別剝離其瘤體，清除非腫瘤組織，稱取重量，計(jì)算平均重量，計(jì)算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=（模型組平均瘤重-環(huán)磷酰胺組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。

1.2.4 組織蛋白的制備每組小鼠各取4個(gè)腫瘤物混合后放入預(yù)冷的組織研磨器內(nèi)，空白組選取部位為小鼠上肢部分肌肉。每個(gè)研磨器內(nèi)加入裂解液500μL，內(nèi)含蛋白酶抑制劑（PMSF）2μL，冰上研磨30 min后轉(zhuǎn)入離心管中，靜置10min后12000 r/min低溫離心15min（4℃），吸取上清，以備蛋白含量檢測。

1.2.5 蛋白質(zhì)濃度測定采用BCA法。將制備好的組織蛋白利用蛋白定量試劑盒進(jìn)行含量檢測。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Wes tern b l ot）法取50μg蛋白加入等體積的蛋白變性液，煮沸10min后，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜、封閉后，分別加入P53、P21、Bcl-2一抗，4℃過夜，TBST緩沖液洗膜后，加入HRP標(biāo)記好相應(yīng)的二抗，待洗膜后，用發(fā)光試劑盒ECL法在暗室中發(fā)光、曝光、顯影、定影。具體方法參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.7 圖像分析采用Alpha Ease FC 4.0軟件進(jìn)行光密度分析，以β-actin條帶的平均光強(qiáng)度為內(nèi)參照，結(jié)果以蛋白的相應(yīng)水平與β-actin的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長小鼠的一般情況

模型組腫瘤小鼠明顯出現(xiàn)精神萎靡不振、食欲較差、畏寒群聚、扎堆、體毛稀疏且干澀、動(dòng)作遲緩而懶動(dòng)的情況，個(gè)別出現(xiàn)瘤皮破潰、腹水形成等生理的異常變化，并且有3只動(dòng)物死亡；而環(huán)磷酰胺組小鼠的狀況較模型組好，但極個(gè)別也有少毛和脫毛、精神萎靡、懶動(dòng)等情況，有1只小鼠死亡。

2.2 S180肉瘤對小鼠腫瘤形成的影響

模型組小鼠在接種后出瘤現(xiàn)象早，發(fā)展快，在剝離瘤塊時(shí)有不易剝離現(xiàn)象，有的質(zhì)地軟爛，有的分界不清，有的甚至粘連到鎖骨和胸骨，說明模型組小鼠荷瘤成功。與空白組比較，模型組出現(xiàn)腫瘤，模型組腫瘤與環(huán)磷酰胺組比較，瘤重顯著增大，兩組差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），環(huán)磷酰胺抑瘤率為83.63%。見表1。

表1 各組腫瘤組織情況（±s）

表1 各組腫瘤組織情況（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別只數(shù)瘤重（g）抑瘤率（%）空白組模型組環(huán)磷酰胺組12 12 12 --1.513±0.790 0.248±0.253*83.63 -

2.3 腫瘤組織中各蛋白表達(dá)情況

空白組與模型組、空白組與環(huán)磷酰胺組比較，3種蛋白表達(dá)水平差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與環(huán)磷酰胺組比較，模型組P53、P21表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，P21表達(dá)差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Bcl-2表達(dá)變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.66）。見表2、圖1。

表2 三組P53、P21、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 三組P53、P21、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組別只數(shù)P53 P21 Bcl-2空白組模型組環(huán)磷酰胺組12 12 12 0.26±0.03 1.23±0.26②2.70±0.38②③0.15±0.02 0.32±0.05②1.30±0.15②④0.23±0.03 1.43±0.28②1.29±0.43②

圖1 Western blot法檢測3種蛋白表達(dá)情況

3 討論

腫瘤是危害人類健康的主要疾病，正日益受到人們關(guān)注。世界各國均對該類疾病的防治與研究進(jìn)行了大量頗有成效的工作，取得顯著進(jìn)展。在臨床上一般采用手術(shù)療法、化學(xué)療法和放射療法治療，但是到目前為止還沒有一種方法可以徹底根治腫瘤。在針對腫瘤的致病機(jī)制和治療研究中，S180瘤細(xì)胞株是常用的研究模型。許多研究表明，S180的致瘤性有時(shí)會(huì)消失，但是具體原因還不得而知[6]。環(huán)磷酰胺在體內(nèi)氧化生成中間產(chǎn)物醛磷酰胺（aldophosphamide），是通過肝細(xì)胞色素P450而完成的，磷酰胺氮芥（phosphamide mustard）從腫瘤細(xì)胞內(nèi)被分解出來再與細(xì)胞的DNA發(fā)生烷化作用，形成交叉聯(lián)結(jié)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖[7]。因此，其常被用于腫瘤研究中的陽性對照。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，其中涉及了大量的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡基因。眾所周知，迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高最經(jīng)典的基因是P53，亦稱為抑癌基因[8]，是人體的抑癌基因。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在近50%的腫瘤患者當(dāng)中存有P53基因缺失或突變[9]，P53基因的失活對腫瘤形成起重要作用[10-12]，而位于P53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子是P21基因。因P21和P53可以共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1檢查站，DNA損傷后不經(jīng)過修復(fù)則無法通過，所以減少了受損DNA的復(fù)制和積累，從而發(fā)揮其抑癌作用，說明正是通過P53-P21這條經(jīng)典的信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。此外，Bcl-2基因（即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，其調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能主要是通過自身二聚體或與Bax等蛋白形成異二聚體來發(fā)揮，而促凋亡的功能可以通過Bax-Bcl-2異二聚體抵消Bcl-2-Bcl-2同二聚體的抑凋亡作用來發(fā)揮[13]。研究還發(fā)現(xiàn)在線粒體細(xì)胞色素C釋放的上游發(fā)揮其抗凋亡作用[14-15]的方法還可以通過阻止caspase的活化，如caspase-2等等。本研究顯示，S180瘤株可能通過抑制P53及P21基因的表達(dá)而達(dá)到致瘤的目的。除此之外，對于S180致瘤性消失原理，也需要進(jìn)行深入研究。

總之，本研究結(jié)果表明，S180瘤株在小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)荷瘤作用穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和致瘤率均可達(dá)到98%以上，明確了致瘤作用是通過降低抑癌基因P53和降低P21基因的表達(dá)，該腫瘤相關(guān)分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，亦為環(huán)磷酰胺抗腫瘤動(dòng)物模型作為陽性藥物對照奠定了重要的理論依據(jù)。

[1]Foley GE，Drolet BP.Sustained propagation of sarcoma of 180 in tissue culture[J].Proc Soc Exp Biol Med，1956，92（2）：347-52.

[2]Foley GE，Drolet BP.Loss of neoplastic properties in vitro 1 observations with s-180 cell lines[J].Cancer Res，1964，24（6）：1461-1467.

[3]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：8119.

[4]韓銳.抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：297-298.

[5]薩姆布魯克，拉塞爾著，黃培堂，等.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 3版.北京：科學(xué)出版社，2002：1713-1726.

[6]Vindelov LL，Christensen IJ，Nissen NI.A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis[J].Cytometry，1983，3（5）：323-327.

[7]Little SA，Mac A，Mirkes PE.Role of the cell cycle in cyclophosphamide（CP）induced teratogenesis[J].Teratology，1991，43（5）：421-422

[8]賈春平.抑癌基因P53與腫瘤研究的最新進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2008，20（3）：450-453.

[9]張艷，何鳳田.p53基因在腫瘤基因治療中的研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2003，11（10）：1593-1596。

[10]KastanMB，Bartek J.Cell-cyclecheckpointsand cancer[J]. Nature，2004，432（7015）：316-323.

[11]Massague J.G1 cell-cycle control and cancer[J].Nature， 2004，432（7015）：298-306.

[12]Olivier M，Hainaut P.TP53 mutation patterns in breast cancers：searching for clues of environmental carcinogenesis[J].Semin Cancer Biol，2001，11（8）：353-360.

[13]Zamzami N，Brenner C，Marzo I，et al.Subcelluar and submitochondrialmode of action of Bcl-2-like oncoproteins[J].Oncogene，1998，16（2）：2265-2282

[14]Burlacu A.Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins[J].JCell Mol Med，2003，7（5）：249-257.

[15]Sprick MR，Walczak H.The interplay between the Bcl-2 family and death receptor-mediated apoptosis[J]. Biochim Biophys Acta，2004，1644（10）：125-132.

Effects and tumorigenic mechanism of S180 cell line in tumor-bearing m icemodel

CHIShuping1ZHANG Shilong1CHEN Hongge1LIU Jun1DU Li1SUN Jie1JIANG ZhengJie2▲CHENG Yun1▲
1.Department of Pharmacy Research Lab,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China;2.Health and Epidemic Prevention Team,Air Force Logistics Department of PLA,Beijing 100005,China

Ob jective To investigate the tumorigenic mechanism of sarcoma cell line(S180)through observing the effects of S180 on bearing tumor formation in mice.M ethods Establishment of solid tumor model in mice,60 Kunming micewere randomly divided into negative controlgroup,modelgroup and positive controlgroup(Cyclophosphamide group) according to the body weight,12mice in each group.The negative controlgroup was given distilled water,0.2mL/10 g. Except for the negative control group,subcutaneous injection with S180 sarcomas cells was done in the mice of other two groups.After the tumormodel ofmice was established,themodel group mice were lavaged daily with 1%sodium carboxymethyl cellulose solution,and Cyclophosphamide group mice were injected Cyclophosphamide,0.02 g/(kg·d). Then the tumor's volume and weightweremeasured,the tumor growth inhibition rate was calculated,and the expression of tissue protein of three kinds of antibody including tumor suppressor gene(P53 and P21)and apoptosis inhibiting gene(Bcl-2)were detected byWestern blotting technology.Results The S180 cells planted tumormodelofmicewasestablished but not appearanced in negative control group.The tumor weight in model group and Cyclophosphamide group was(1.513±0.790)g and(0.248±0.253)g,respectively,it was significantly different(P＜0.01)between the two groups.The inhibitory rate of positive control group was 83.63%.Compared with positive control group,the P53,P21 and Bcl-2 protein levelswere significantly different in themodel group and Cyclophosphamide group(P＜0.01).Compared with positive control group,the P53 and P21 protein level significantly decreased inmodel group(P＜0.05),the difference of P21 was highly statistically significant(P＜0.01),the changes of Bcl-2 were not statistically significant (P=0.66).Conclusion The S180 sarcoma cellsmay promote tumor formation by inhibiting expression of P53 and P21.Thismechanism can provide important experimental evidence for tumor animal model for screening drug and tumormechanism.

S180;Western blotting;P53;P21;Bcl-2

R730

A

1673-7210（2014）09（c）-0009-04

2014-04-15本文編輯：程銘）

國家重大科技專項(xiàng)課題重大新藥創(chuàng)制課題（編號(hào)2009ZX09103—356）。

遲淑萍（1960.12-），女，山東棲霞人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師；研究方向：免疫學(xué)。

▲共同通訊作者